核转录因子和明胶酶在鼻息肉中的表达及临床意义

孙树军，赵立民，殷宪宝

（1.潍坊医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，山东 潍坊 261030；2.山东省枣庄市立医院耳鼻咽喉科，山东 枣庄 277000）

·临床论著·

核转录因子和明胶酶在鼻息肉中的表达及临床意义

孙树军1，赵立民1，殷宪宝2

（1.潍坊医学院附属医院耳鼻咽喉头颈外科，山东 潍坊 261030；2.山东省枣庄市立医院耳鼻咽喉科，山东 枣庄 277000）

目的观察核转录因子（p-STAT3）及明胶酶（MMPs）在鼻息肉组织中的表达情况，探讨两者在鼻息肉发病过程中的作用及相互关系，为鼻息肉的临床治疗提供帮助和新的思路。方法收集潍坊医学院附属医院耳鼻喉科2008年5月-2013年4月期间行鼻内镜手术的患者45例（鼻息肉组35例，下鼻甲黏膜组10例），采用常规病理和免疫组织化学方法检测p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉及下鼻甲组织中的表达情况。结果MMP-2、9在鼻息肉组和下鼻甲黏膜组的表达分别为68.6%（24/35）、20%（2/10)；82.9%（29/35）、20%（2/10），鼻息肉组与下鼻甲黏膜组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。p-STAT3在鼻息肉及下鼻甲黏膜组的阳性表达率为71.4%（25/35）、0.0%，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05)。P-STAT3和MMP-2、9存在着正相关关系（r =0.278，r=0.312，P＜0.05）。结论p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉组织的高表达和正相关性说明两者在鼻息肉的发病过程中起着重要作用，可作为临床治疗鼻息肉病的检测指标之一。

STAT3；MMP-2、9；鼻息肉；免疫组织化学

鼻息肉是多种原因导致的鼻腔及鼻窦慢性炎症性疾病，鼻息肉的主要组织病理特征是上皮下水肿和炎症细胞浸润，而且伴随上皮层的增生、纤维化和基底膜的增厚。这些特征性改变需要多种因素结合才能完成，Th淋巴细胞，尤其是Th17细胞在鼻息肉的发病过程中扮演了重要的角色，对于多种细胞因子联系过程和鼻息肉的发病机制现在不是很明确[1]。

细胞外基质有过多的细胞集聚是鼻息肉组织形成的基础。细胞外基质组成基底膜，并且包绕和支持黏膜细胞，细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）的合成和降解对于细胞的平衡非常重要。核转录因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）在胞外信号的作用下其酪氨酸基团被JAK（Janus Kinase，JAK）磷酸化，以二聚体的形式进入胞核内，与胞核中特异的基因片段相结合，调节下游基因及相关蛋白的表达。并在IL-6的刺激下参与Th17细胞的增殖活化，由STAT3介导下引起的Th17细胞反应在哮喘等免疫及炎症性疾病的发病中发挥关键作用[2]。

本研究从这点出发通过收集相关的临床标本，采用免疫组织化学方法，检测p-STAT3及明胶酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在鼻息肉中的表达，初步探讨它们在鼻息肉发生发展中的作用和机制，并分析它们之间的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料

收集2008年5月-2013年4月期间在潍坊医学院附属医院耳鼻咽喉科住院期间行鼻内镜手术的患者，共45例。其中鼻息肉组35例，男26例，女9例，年龄20～55岁，平均38岁；下鼻甲组10例，男8例，女2例，年龄17～42岁，平均32岁。所有患者无变应性鼻炎、哮喘等病史，无服用类固醇皮质激素、抗组胺药物等病史。按照中华医学会耳鼻喉科学分会关于慢性鼻窦炎鼻息肉临床分型分期及内窥镜鼻窦手术疗效评定标准（1997年，海口）分型，鼻息肉组其中Ⅱ型1期9例，Ⅱ型2期18例，Ⅱ型3期3例，Ⅲ型5例。对照组（下鼻甲黏膜组）：均为慢性肥厚型鼻炎有双侧下鼻甲肥大患者。见表1。

1.2仪器及试剂

主要仪器：切片机、电热恒温培养箱、全自动显微照相系统、电子显微镜、病理组织包埋机等。主要试剂：鼠抗人STAT3多克隆抗体、鼠抗人MMP-2、9多克隆抗体、免疫组织化学染色试剂盒（SP-6000）、DAB显色试剂盒等均来自北京中山生物有限公司。

1.3方法

术中收集标本中性福尔马林固定，进行常规病理检查。免疫组织化学采用SP法按照说明书进行。将待用的石蜡切片取出后置于60℃的烤箱内烤片，常规脱蜡入水，用PBS冲洗切片；抗原修复：修复时间为15～20 min。自然冷却后PBS冲洗3遍；室温孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗3次；EDTA微波抗原修复，滴加非免疫性动物血清，室温下卵育10 min，倒去血清后，滴加一抗工作液（MMP-2、9或STAT3抗体稀释液），切片分开滴加一抗，4℃冰箱过夜，0.01 MPBS冲洗3次。同时做阴性对照，控制条件与此前相同，只是用PBS溶液替代一抗。滴加生物素化二抗PBS液冲洗5 min 3次。滴加辣根酶标记链酶卵白素工作液（S-A/HRP），DAB显色，苏木精复染。以对应的鼠抗人阴性IgG作为对照，以已知的阳性组织作为阳性对照组。

1.4结果观察

以高倍镜和低倍镜分别观察p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉组织中的阳性表达情况，每一切片均经2位病理医师进行单盲法评估，并取平均值。阳性细胞以细胞质或细胞核被染成棕黄色或棕褐色为阳性细胞，采用半定量方法确定阳性结果及积分情况，在高倍镜下随机选取5个阳性细胞数多的视野进行结果判定及评分：阳性细胞数≥75%为4分，阳性细胞数51%～75%为3分，阳性细胞数11%～50%为2分，阳性细胞数≤10%为1分，阴性为0分。棕褐色为3分，棕黄色为2分，淡黄色为1分，不着色为0分。两个指标相乘得分，所得结果＞3分即为阳性。把所得结果分为4个等级：阴性（-）为0～2分，（+）为3～4分，（++）为6～8分，（+++）为9～12分。

1.5统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析，所得结果用χ2检验和Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1STAT3表达情况

p-STAT3阳性表达主要在鼻息肉黏膜和腺体上皮细胞质，呈棕黄色和棕褐色，周围少许细胞呈淡

黄色表达（见图1、2）。阳性表达率为71.4%（25/35），在下鼻甲黏膜组织未见阳性表达（见图3）。鼻息肉组中（+）5例,（++）7例,（+++）13例。鼻息肉组阳性表达率明显高于下鼻甲组，两者比较有统计学意义（χ2=31.96，P＜0.05）。（见表1）。

图1 鼻息肉组织黏膜上皮STAT3表达，阳性（×400）

图2 鼻息肉组织腺体上皮STAT3表达，阳性（×400）

图3 正常下鼻甲黏膜STAT3表达，阴性（×400）

表1 STAT3在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表达情况

2.2明胶酶表达情况

MMP-2阳性表达主要在鼻息肉黏膜和腺体上皮细胞质，呈棕黄色、棕褐色和淡黄色表达，阳性表达率为68.6%（24/35），其中（+）10例，（++）8例，（+++）6例（见图4）。下鼻甲组阳性表达率为20%（2/ 10）（见图5），其中（+）2例，鼻息肉组阳性表达明显高于下鼻甲组，两者比较有统计学意义（χ2=7.54，P＜0.05）（见表2）；MMP-9阳性表达主要在息肉黏膜及腺体上皮细胞质中，呈棕黄色和棕褐色表达（见图6），阳性表达率为82.9%（29/35），其中（+）7例，（++）12例，（+++）10例，下鼻甲组阳性表达率为20%（2/10），其中（+）2例，鼻息肉组阳性表达明显高于下鼻甲组，两者比较有统计学意义（χ2=14.36，P＜0.05）。见表3。

图4 鼻息肉组织中腺体上皮MMP-2表达阳性（×400）

图5 正常下鼻甲黏膜中MMP-2表达，阴性（×400）

2.3p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉中表达的相关性

鼻息肉组p-STAT3阳性表达25例，其中15例MMP-2阳性表达，10例阴性表达；18例MMP-9阳性表达，7例阴性表达。强阳性例数p-STAT3 20例；MMP-2 14例；MMP-9 22例。3组阳性表达虽无统计学意义但强阳性表达p-STAT3和MMP-9高于MMP-2。在p-STAT3阴性表达10例中有3例

MMP-2阳性表达、5例MMP-9阳性表达。对所有数据进行统计学分析，使用Spearman相关分析方法：p-STAT3与MMP-2之间：r=0.278，P＜0.05。P-STAT3和MMP-9之间：（r=0.312，P＜0.05），说明p-STAT3与明胶酶之间存在正相关性关系。见表4。

表2 MMP-2在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表达情况

图6 鼻息肉组织中黏膜上皮MMP-9阳性表达（×400）

表3 MMP-9在鼻息肉和正常下鼻甲黏膜中的表达情况

表4 鼻息肉组织中MMP-2、9表达和STAT3的相关性分析

3 讨论

JAK-STAT（Janus Kinase-signal transducer and activator of transcription）信号转导途径调节炎症因子从而影响病变过程，在正常调节下，这种途径有通过负反馈机制抑制炎症反应有积极的一面。STAT3与细胞增生及分化密切相关，活化的T细胞分泌多种细胞因子与细胞表面相应受体结合，通过信号转导通路将胞外信号转导至胞核内，调节细胞生长。STAT3是一种重要的转录因子，调控许多肿瘤血管的形成、影响各种细胞周期、细胞凋亡等相关基因的表达，如明胶酶、VEGF、酪氨酸激酶Src等[3]。LINKE等[4]通过Western blot和免疫组织化学法发现鼻息肉组STAT3-mRNA水平与下鼻甲组比较无差异性，但其数量明显高于对照组（P＜0.01），免疫组织化学发现P-STAT3主要在下鼻甲组的表浅上皮层细胞表达，在间质或上皮层基底细胞无表达情况，而鼻息肉组无论在上皮层还是间质、基底细胞层都有表达现象。STAT3在鼻息肉增殖中发挥重要作用。

笔者采取免疫组织化学方法发现p-STAT3在鼻息肉组表达明显增强，阳性表达率71.4%，以息肉黏膜上皮和腺体上皮细胞表达为主，在下鼻甲组织上皮中无阳性表达情况，两者比较差异有统计学意义。说明p-STAT3在鼻息肉中发挥重要作用。国内研究表明STAT3在鼻息肉中黏膜上皮及腺体的表达的阳性率为66.67%，鼻息肉组STAT3表达明显高于下鼻甲组33.33%（P＜0.01）。p-STAT3在鼻息肉中黏膜上皮及腺体表达的阳性率为56.67%，鼻息肉组p-STAT3表达明显高于下鼻甲组43.33%（P＜0.01）[5]。

组织重塑近年来成为研究热点之一，细胞外基质的降解和生成是组织的重建和病理过程。鼻息肉是上呼吸道的慢性炎症疾病，组织特点为炎症细胞的浸润、上皮细胞的过度分化和组织重建，而细胞外基质的增厚和水肿是导致鼻息肉形成和反复发作的基础[6]。息肉中大量明胶酶的表达诱发基底膜胶原和明胶降解，伴随大量微血管的增生和极有利于大分子物质如纤维蛋白原通过，随后发生血浆外渗增多，细胞外基质蓄积，导致组织水肿，局部张力增加挤压上皮，局部缺氧更易使上皮破裂，逐渐形成息肉[6]。

明胶酶包括MMP-2和MMP-9，能有效降解明胶和基底膜的主要成分Ⅴ、Ⅳ、Ⅹ、Ⅸ型胶原，其高表达可导致细胞外基质和血管基底膜降解加速，在多种炎症性和肿瘤性疾病致病过程中发挥重要作用。国外研究发现在鼻息肉中MMP-9的高表达可能破坏基底膜的胶原质和上皮，导致血管通透性增加和间质水肿。在鼻内镜鼻息肉手术后复发病例中有更多的MMP-9表达情况，说明MMP-9在鼻息肉的病理过程中发挥重要作用[6]。

该研究中明胶酶MMP-2和MMP-9在鼻息肉组织中有高表达情况，其阳性表达率分别为68.6%和82.9%，明显高于对照组下鼻甲组表达。MMP-2阳性表达主要在鼻息肉黏膜和腺体上皮细胞质，少许在细胞核，呈棕黄色、棕褐色和淡黄色表达，其强阳性表达例数少于MMP-9，其中MMP-2强阳性表达例数为（+）10例，（++）8例，（+++）6例。MMP-9主要在息肉黏膜及腺体上皮细胞质中，呈棕黄色和棕褐色表达，强阳性表达例数（+）7例，（++）12例，（+++）10例。两者阳性表达率及强阳性表达例数比较差异无统计学意义，但MMP-9阳性和强阳性表达例数高于MMP-2，说明MMP-9在鼻息肉组织表达敏感性高于MMP-2。陈江波等[7]研究指出MMP-9在复发组及嗜酸性粒细胞组鼻息肉的高表达，提示MMP-9可能通过增加嗜酸性粒细胞在鼻黏膜局部的浸润，影响了鼻息肉的预后。MMP-9可能作为鼻息肉复发的危险因子之一。

STAT3是在多种细胞因子相应受体结合后，激活酪氨酸激酶，从而被其磷酸化，然后形成二聚体，再转位至核中，与DNA上的靶基因结合，激活靶基

因的转录[3]。而明胶酶有可能在与p-STAT3联系后被激活而发挥相应作用。本研究通过免疫组织化学发现p-STAT3和MMP-2、9在鼻息肉的黏膜和腺上皮中有高表达，而且明显强于正常下鼻甲黏膜的表达。本研究发现在鼻息肉组织中p-STAT3和MMP-2、9呈正相关性，说明MMP-2、9在鼻息肉的发病过程中有重要的作用，阻断p-STAT3的信号转导可下调明胶酶的表达，使鼻息肉的生长减慢。因此，笔者认为抑制p-STAT3蛋白通路可能有望成为一条治疗鼻息肉的新途径。

[1]PIN ZHIR CHAO,CHI-MING CHOU,CHEN-HO CHEN.Plasma RANTES and eotaxin levels are correlated with the severity ofchronic rhinosinusitis[J].EurArchOtorhinolaryngol,2012, 269(11):2343-2348.

[2]HAKAN CINCIK,EVREN ERKUL,DOGAN PINAR,et al.E-valuation of MMP-9 and TIMP-1 levels of the patients with nasal polyposis after corticosteroid therapies[J].Indian J Otolaryngol Head Neck Surg,2013,65(Suppl 2):S445–S449.

[3]BABON JJ,KERSHAW NJ,MURPHY JM,et al.Suppression of cytokine signaling by SOCS3:characterization of the mode of inhibition and the basis of its specificity[J].Immunity,2012,36(2): 239–250.

[4]LINKE R,PRIES R,KÖNNECKE M,et al.Increased activation anddifferentiatedlocalizationofnativeandphosphorylated STAT3 in nasal polyps[J].Wollenberg B.Int Arch Allergy Immunol,2013,162(4):290-298.

[5]张涛,曹庆松,王丽华.鼻息肉中STAT3和VEGF的表达与相关性研究[J].华中国病理生理杂志,2009,25(5):993-997.

[6]CHEN-YUCHIEN,CHIH-FENGTAI,WEN-REIKUO,et al.Matrix metalloproteinase-9 gene polymorphisms in nasal polyposis[J]. BMC Medical Genetics,2010,11:85-92.

[7]陈江波,王天生,孙虹.基质金属蛋白酶-9和嗜酸粒细胞在鼻息肉组织的表达及其对预后的影响[J].临床耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2009,23(18):840-842.

（张蕾 编辑）

Expression and clinic function of STAT3 and MMP-2 and 9 in nasal polyp tissue

Shu-jun SUN1,Li-min ZHAO1,Xian-bao YIN2
(1.Department of Otorhinolaryngology,the Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang,Shandong 261030,P.R.China;2.Department of Otorhinolaryngology,the Municipal Hospital of Zaozhuang,Zaozhuang,Shandong 277000,P.R.China)

【Objective】To observe the expression and clinical role of p-STAT3 and MMP-2 and 9 in the tissue of nasal polyps and to investigate their relationship in the development of nasal polyps so as to provide help and new ideas for clinical treatment of nasal polyps.【Methods】The expressions of p-STAT3 and MMP-2 and 9 were detected in the tissue of nasal polyps and inferior turbinate by routine pathologic and immunohistochemical methods.A total of 45 patients received nasal endoscopic surgery in the Department of Otorhinolaryngology of the Affiliated Hospital of Weifang Medical University from May 2008 to April 2013 (35 cases in nasal polyp group and 10 cases in the inferior turbinate mucosa group).【Results】The expression rates of MMP-2 and MMP-9 were 68.6%(24/35)and 82.9%(29/35)in the nasal polyp group and 20% (2/10)and 20%(2/10)in the inferior turbinate mucosa group,respectively.There was obvious difference between both groups(P＜0.05).The expression rate of p-STAT3 was 71.4%(25/35)and 0.0%in the nasal polyp group and the inferior turbinate mucosa group respectively,there was a statistical difference between both groups(P＜0.05).There were positive correlations between p-STAT3 and both MMP-2 and 9(r=0.278 and 0.312,P＜0.05).【Conclusions】The high expressions of p-STAT3 and MMP-2 and 9 in nasal polyps and positive correlations illustrate they all play important roles in the pathogenesis of nasal polyps and can be used as markers of clinical treatment for nasal polyposis.

STAT3;MMP-2;MMP-9;nasal polyp;immunohistochemistry

R765.2

A

1005-8982（2015）27-0036-05

2015-04-14