DNMT3b基因多态性及其在胃癌组织中的表达水平与胃癌的关联性分析

王 川，贾志芳，曹东慧，武 兴，曹雪源，姜 晶

（1.吉林大学第一医院临床流行病学研究中心，吉林 长春 130021；2.吉林大学第一医院胃结直肠外科，吉林 长春 130021）

胃癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率均位于第3位［1］。中国成年人中有50%以上感染幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp），但只有少数个体最终发展成胃癌，提示宿主遗传因素在胃癌的易感性方面有重要作用［2］。随着近年来胃癌分子遗传学研究的深入，与基因转录过程相关酶的基因多态性研究得到了广泛开展。DNA甲基化是常见的表观遗传修饰，由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）家族催化，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b［3］。DNMT3b的主要功能是参与从头甲基化，以非甲基化的DNA为模板，催化新的甲基化位点形成［4］。抑癌基因启动子区CpG岛如果呈现高甲基化状态，则抑癌基因失活。国内外研究［5］显示：胃黏膜组织中异常表达的DNA甲基转移酶，可能为癌症发生的早期阶段创造了条件。个体单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）差异可能使DNA甲基转移酶的表达水平不同，从而使得个体对肿瘤的易感性存在差异。已有研究［6－7］结果显示：DNMT3b基因多态性与人类结直肠癌、肺癌等肿瘤易感性有关。目前国内对DNMT3b基因多态性的研究多局限于启动子区或单个SNPs位点。本研究选择DNMT3b基因的5个SNPs位点，采用病例对照研究方法，探讨DNMT3b基因多态性是否影响其蛋白表达水平及其与胃癌的关系，为胃癌的病因学研究提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 采用病例对照设计。病例组为2008—2010年本院收治的胃癌患者，共447例。病例组纳入标准：来自吉林省长春市，中国北方汉族人，年龄30～90岁，在本院胃结直肠外科行手术治疗，并经病理报告明确诊断为非贲门部胃癌；其中男性322例，女性125例，年龄35～90岁，平均年龄（61.70±11.09）岁。对照组为同时期在本院体检中心体检的健康对照者，共961名，其中男性564名，女性397名，年龄35～79岁，平均年龄（50.40±8.51）岁。对照组纳入标准：血清Hp－IgG检测阴性（＜30EIU），无萎缩性胃炎和恶性肿瘤史，常规体检结果均正常，按年龄、性别频数匹配挑选。排除标准：年龄小于30岁或大于90岁者，非中国汉族北方人群，并发其他严重疾病可能会影响到胃癌病情进展者。所有受试者均知情同意，研究方案经本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂和仪器 HpIgG抗体（Biohit公司，芬兰），全血基因组DNA提取试剂盒（Axygen公司，美国）；Multiskan GO1510全波长酶标仪（Thermo Fisher Scientifc公司，美国），S1000TM热循环仪（Bio－Rad公司，美国）。基因分型检测由美国Applied Biosystems公司完成。

1.3 Hp感染检测和基因组DNA提取 采集所有研究对象外周血500μL并冷冻保存（EDTA K2抗凝，－80℃）。酶联免疫吸附（ELISA）法检测所有研究对象血清中HpIgG抗体（Biohit公司，芬兰），使用Multiskan GO 1510全波长酶标仪检测450nm波长处的吸光度（A）值，计算样本的酶免疫单位（EIU）数值，结果≥30EIU判定为阳性。使用Axyprep血基因组DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，按照说明书进行操作。

1.4 SNPs位点的选择和分型 使用SNP browser软件筛选HapMap数据库中国汉族人群DNMT3b基因的标签SNP位点，要求最小等位基因频率（MAF）＞0.10，同时r2＞0.8。共22个SNPs位点满足 MAF＞0.10，其中18个SNPs显示与标签SNPs的完全连锁不平衡（D′＝1，r2＞0.8），最终选择了rs6119954、rs4911107、rs4911259和rs8118663共4个标签SNPs位点以及基因启动子区rs1569686位点进行测定，采用TaqMan技术确定每个SNPs位点的基因分型。BIO－RAD S1000TM热循环仪设置的扩增程序：95°C、10min，95°C、15s，60°C、1min，共40个循环。

1.5 免疫组织化学法检测胃癌组织和癌旁组织中DNMT3b多态性与基因表达的关系 采用链霉素－生物素－过氧化物酶法对104例胃癌患者的胃癌组织和85例患者的癌旁对照组织进行了免疫组织化学染色，由2名独立的病理学家进行评分。采用HSCORE评分系统评估染色强度及特定强度范围内细胞染色的百分比：HSCORE＝∑Pi（i）（i＝0，1，2，3，Pi＝0～100%）。i代表肿瘤细胞的染色强度（无染色＝0，弱染色＝1，中度染色＝2，强染色＝3），Pi是每一个强度下肿瘤细胞染色的百分比，范围0～100%。HSCORE总分为各强度得分之和，结果为0～300，依据表达水平的高低分为高表达（HSCORE＞200）、中度表达（100＜HSCORE＜200）、低表达（HSCORE≤100）和阴性（HSCORE＝0），结果以中位数（四分位数）表示。

1.6 统计学分析 采用SAS 9.2统计软件进行统计学分析。采用拟合优度χ2检验分析对照组研究对象的基因型频率分布是否符合Hardy－Weinberg（H－W）平衡。病例组和对照组研究对象的基因型及其他指标的分布情况比较采用χ2检验或Fisher’s确切概率法。调整性别、年龄和Hp感染的作用后，采用非条件Logistic回归分析计算基因型与胃癌危险性的OR值及95%可信区间（CI）。DNMT3b基因多态性与表达水平的关联分析采用Mann－Whitney U 检验或Kruskal－Wallis H 检验。

2 结 果

2.1 研究对象的一般特征 与对照组比较，病例组患者的年龄大，男性所占比例高，故后续的统计分析均调整了年龄和性别因素的影响；病例组患者中Hp抗体阳性率明显高于对照组（69.1%vs 49.7%，P＜0.001）；病理分期方面，病例组进展期胃癌患者居多，Ⅱ、Ⅲ期共占72.7%；分化程度方面，低分化者占62.9%；Lauren分型显示病例组肠型胃癌为主要病理类型，占68.2%。2组研究对象的一般特征见表1。

2.2 DNMT3b基因多态性与胃癌的关联性 对照组研究对象DNMT3b的5个SNPs位点rs6119954、rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663均进行了 Hardy－Weinberg平衡检验，其P 值分别为 0.036、0.321、0.341、0.362和0.874。rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663均符合Hardy－Weinberg平衡，但rs6119954偏离了Hardy－Weinberg平衡，随机挑选了100例研究者进行了实验验证，结果相同，故仍将该位点纳入分析。调整年龄、性别和Hp感染等因素，利用非条件Logistic回归分析DNMT3b基因多态性与胃癌的关联结果表明：与携带GG基因型比较，携带rs6119954AA基因型的个体发生胃癌的危险性是其1.25倍（95%CI：0.86～2.10，P＝0.19）。在其他4个SNPs位点上，同样均未发现DNMT3b基因多态性与胃癌的发生有关联。见表2。

表1 研究对象的一般特征Tab.1 General characteristics of subjects［n（η／%）］

2.3 DNMT3b基因多态性和胃癌组织中DNMT3b蛋白表达水平的关系 免疫组织化学染色结果显示：多数患者DNMT3b蛋白在胃癌组织的细胞核中呈高表达，仅在少数患者胃癌组织的细胞质中呈弱表达。在胃癌组织中DNMT3b的HSCORE为180（140～240），癌旁对照组织中DNMT3b的HSCORE为90（0～240），胃癌组织中DNMT3b的表达水平显著高于癌旁对照组织（P＜0.001）。DNMT3b基因的5个SNPs的不同基因型间DNMT3b蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

3 讨 论

DNA异常甲基化导致的抑癌基因失活在肿瘤早期发生过程中起重要作用［8－9］。既往对DNMT3b基因多态性的研究［10］中，大都局限于启动子区单个转录起始位点（如－149C→T），本研究通过SNPs数据库筛选，挑选出覆盖DNMT3b基因的4个标签SNPs，还添加了1个位于启动子区域的SNP，更全面地分析了DNMT3b基因多态性与胃癌之间的关系。

表2 病例组和对照组DNMT3b基因型频数分布Tab.2 Distribution of genotypic frequencies of DNMT3bin case and control groups

表3 DNMT3b基因多态性与胃癌组织中DNMT3b蛋白表达水平的关系Tab.3 Relationship between DNMT3bgene polymorphisms and expression level of DNMT3bprotein in gastric cancer tissue

Hu等［11］研究发现：启动子区转录起始点上游－579G＞T位点（rs1569686）的基因多态性与胃癌的易感性相关，与对照组比较，携带G等位基因的个体患胃癌的易感性显著降低。本研究虽然在更大规模的中国人群中进行验证，却未发现rs1569686基因多态与胃癌的易感性有关联。有研究［12－13］显示：DNMT3b基因启动子区－149位的SNP（rs2424913）T等位基因变异可以使转录活性增加30%，使DNMT3bmRNA和蛋白表达水平升高，T等位基因携带者患肺癌风险几乎是CC型的2倍，而乳腺组织中携带C等位基因者更易罹患乳腺癌，因此研究者们也关注了rs2424913位点与胃癌发生的关系［10－11，14］。Aung等［15］对日本人群进行了研究，在病例组与对照组中未发现等位基因频率分布的差异，这与 Wang等［10］和Hu等［11］对中国人群的研究结论一致。不同研究结果的差异可能是由于SNPs的罕见基因型频率在不同种族间分布差异引起的，中国汉族人群和日本人群rs2424913位点的C等位基因频率分别为1.2%和0.6%，而美国白人C等位基因的频率为59.7%（HapMap数据库的检索结果），因此以中国汉族人群和日本人群为对象的研究其检验效能不足，难以发现rs2424913和胃癌之间的关联。由于本研究中病例组人数仅为447人，汉族人群中C等位基因的频率也仅为1.2%，其检验效能远低于0.8，因此本研究未纳入该位点。Yang等［14］在中国南方人群中对DNMT3b的rs2424908SNP进行了研究，但未发现rs2424908SNP与胃癌发生有关联，由于rs2424908和rs8118663有完全的连锁不平衡（D′＝1，r2＝1），本研究则选择rs8118663进行研究，同样未发现其基因变异与胃癌发生有关联。本研究所选取的胃癌患者均为非贲门癌，而在Yang等［14］的研究中包括了贲门癌和非贲门癌的患者，目前公认这2种组织类型的胃癌在病因、生存和预后方面存在明显差异，因此病例的抽样是否导致结论发生偏倚还需要更大规模研究的验证。

蛋白质是基因表达的产物，其功能是参与维持DNA甲基化状态，本文作者推测肿瘤组织中如能检出DNMT3b蛋白的高表达，可能提示DNMT3b参与了肿瘤的形成。Su等［16－17］研究发现：DNMT3b主要在原发性胃肿瘤中过表达，这种表达水平上的差异与临床病理学有关联，同时Hp感染可能导致DNMT3b高表达。本课题组虽然发现了胃癌患者肿瘤组织中DNMT3b蛋白高表达，但未发现胃癌患者中携带不同基因型的个体肿瘤组织中DNMT3b表达的差异。因此肿瘤组织中DNMT3b高表达可能来源于表观遗传学改变和蛋白翻译后修饰，而与基因多态性无关联。

综上所述，DNMT3b基因的rs6119954、rs1569686、rs4911107、rs4911259和rs8118663位点的SNPs与胃癌的发病风险无关联，并且该基因多态性与DNMT3b蛋白表达水平也无关联，提示DNMT3b基因多态性在中国北方汉族人群中尚不能作为预测个体对胃癌易感性的遗传标记。

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