海产品中霍乱弧菌实时浊度LAMP检测方法的应用

梁华丽

（汕尾出入境检验检疫局，广东汕尾516600）

·应用研究·

海产品中霍乱弧菌实时浊度LAMP检测方法的应用

梁华丽*

（汕尾出入境检验检疫局，广东汕尾516600）

通常弧菌类的细菌不但能够在动物中传播，而且还能够传染给人类。病原性的弧菌则是在海水养殖类动物体内很常见的细菌性病原体，它的流行速度非常快，伤害也非常大，严重影响了包括海水鱼、贝壳类生物养殖业的正常运转。霍乱弧菌拥有高度的致病性，海产品如果被霍乱弧菌感染，细菌就可能会在其体内长时间留存，还会随着生物的活动污染水资源，最后还会通过寄生体传染给人类，形成非常严重的疾病泛滥，历史上曾经有过多次关于霍乱灾难的记载。由此，在对海水产品进行养殖的过程中，绝对不能放松对霍乱弧菌进行检测和控制的力度，必须建立起具有高度时效性以及高度敏感性的检测判断方法，借此大大减少检测时间，进而尽可能降低其对养殖业的伤害以及对人们身体健康乃至于生命的威胁。

1 霍乱弧菌以及当前检测情况概述

霍乱弧菌是造成霍乱在人类群体中大面积传播的罪魁祸首，在历史记载当中，霍乱是大量非常古老并且流行起来范围很广、伤害性很高的烈性传染病之一，曾经是一种“不治之症”，引起过多次大面积骚乱，其主要病症表现为呕吐以及腹泻，最终脱水致死，死亡率极高，国际检疫部门将其认为是一种严重的传染疾病。霍乱弧菌属于革兰氏阴性细菌，在菌体表面存在单鞭毛以及菌毛，有一部分存在荚膜，大量的细菌群当中，01细菌群以及0139细菌群有高度致病性，一旦扩散就很可能会造成严重的霍乱。

通常人类感染霍乱弧菌的途径是被感染的水下生物传染造成的饮水传染。或者是通过食物直接入口感染。在条件满足的情况下，霍乱弧菌会迅速进入生物体的小肠部分，并且能够依靠其鞭毛自主运动，可以灵活地越过机体黏膜表面自带的粘液层，同时还可能会借助菌毛运动与肠壁细胞相粘合，一旦寻找到适合其生存繁衍的“沃土”就会迅速繁殖，产生具有强烈毒性的肠毒素。霍乱弧菌的潜伏期极短，但是发病极快，患者往往措手不及。在发病后，患者会出现上吐下泻的症状，这也是这种疾病典型的特点。可以肯定的是，无论哪种传播途径，霍乱弧菌的传播都和海产品或者淡水产品的感染有关，因此对海产品以及淡水产品进行霍乱弧菌的检测是非常重要的。

对于传统的检测霍乱弧菌的方法，存在操作繁琐的弊端，且检测需要的周期非常长，不能同时进行大批量的样品检测。近几年发展起来的检测方法，如免疫学方法以及荧光定量法等检测成本偏高，并不适合在基层检测部门及单位进行推广和使用。

环介导等温扩增法（LAMP）是近几年发展起来的一种新的检测技术，这种方法可以在恒温环境中很好地识别靶DNA中的特定区域，引物和DNA聚合酶扩增的核酸，并且拥有高度的灵敏性以及特殊性，实际操作起来也十分有效且便捷。在当前的科技环境下，这种技术逐渐开始在食源性致病菌的检测中得到应用，不过对于霍乱弧菌实时浊度LAMP试验所拥有的技术效果还没有系统的研究分析报告。因此，本研究将对霍乱弧菌中的ctrA基因进行LAMP引物的设计，建立起适合霍乱弧菌检测的LAMP检测办法，可以有效且迅速地降低对霍乱弧菌进行检测所要花费的时间和精力，并且为未来控制或预防霍乱弧菌大面积传染打下良好的理论基础。

2 材料与方法

2.1 试验材料

菌株：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、非致病性霍乱弧菌分离菌株、拟态弧菌分离菌株、创伤弧菌，北京陆桥股份有限公司。

试剂：缓冲蛋白胨水、碱性蛋白胨水，北京陆桥技术责任有限公司；DNA抽取提取试剂盒、荧光定量测试试剂盒、霍乱弧菌致病性组DNA、扩增试剂盒、反应管，北京蓝谱生物科技有限公司。

设备：实时浊度仪，日本荣研公司；分光光度计，日本岛津公司。

2.2 试验方法

2.2.1 提取细菌基因组DNA

把供试验的菌株放置在增菌培养基中进行培养，需要注意的是弧菌选择碱性蛋白胨水来进行培养，其他的菌株则选择缓冲蛋白胨水来进行培养，依照试剂盒提供的说明书来进行细菌基因组的提取，建立起供参考的菌株DNA模板库，并且将其置于-20℃左右的环境中，随时备用。

2.2.2 设计LAMP引物，计算长度

对比霍乱弧菌的基因序列，对于霍乱弧菌中包含的ctxA基因使用pr软件进行引物设计，设计数量为3组，分别命名A、B、C组，并且由专门的单位完成合成的步骤，其具体长度情况见表1。

表1 霍乱弧菌中的ctxA基因扩增后LAMP引物的序列长度

2.2.3 筛选LAMP引物

对ctxA基因进行有针对性设计出的3组引物实时进行同步扩增，并且使用浊度仪来对其扩增效率进行检测，并且在这之后有限选择其中扩增效率最高并且没有出现明显的非特殊性扩增的一组。

2.2.4 扩增

实时扩增反应表现在浊度仪上，具体反应体系是25 μL，具体情况见表2。

表2 浊度仪中表现的实时扩增反应

除此之外，引物混合液在PM中的反应引物（反应条件：温度65℃，反应时间：60 min）所具备的浓度情况见表3。

表3 引物混合液在PM中的反应引物所具备的浓度表

2.2.5 判别试验结果

察浊仪器，浊度如果超过0.1，则认为是阳性。此处需要注意的是，将霍乱弧菌性基因组DNA认定为阳性组，同时将双蒸水作为空白组进行对照，其他菌株作阴性对照组，同时开始LAMP扩增的操作。

2.2.6 扩增具备的灵敏性

通过分光光度计来对霍乱弧菌致病性基因组进行DNA含量的测定，原液稀释，按照模板进行扩增操作，对其灵敏度进行总结记录。

2.2.7 对海产品当中是否含有霍乱弧菌进行检测

选取若干海产品，约100份，进行同样的前处理后，进行预增菌，并进行细菌基因组DNA的提取，通过LAMP检测方法以及采用SN/T 1022—2010进出口食品霍乱弧菌检测进行对比操作，证实LAMP检测法拥有可靠的实用性。

3 结果与分析

3.1 筛选引物试验结果

将3组引物依照霍乱弧菌DNA作为基础模板同时进行LAMP反应测试，并分别设置空白组进行对照，试验扩增情况见图1。由图1可知，这3组引物都可以发生一定的反应，而空白组并没有发生任何DNA扩增现象，其中A组引物组的扩增最快，同时也是出峰的时间最早一组。因此，选择A组作为本次研究的最优组。

图1 3组引物以及空白组引物扩增情况曲线图

3.2 扩增灵敏性试验结果

在基因组DNA含量测试结果中，霍乱弧菌致病组的DNA含量是8 ng/μL，稀释之后进行了检测，其结果如图2所示。

图2 灵敏性扩增情况曲线图

在发生反应的60 min之内，6份样品的浊度基本上都呈现出了阳性，同时，随着模板不断降低的浓度，反应的速率依然保持基本不变的状态，反应的峰值出现的具体时间逐渐延迟，但是始终保持有效扩增，说明霍乱弧菌可以不断地扩增稀释。在此次反应当中，从产物的量来看，可以说明临近值判定成阳性花费的时间只有4 min，证明这种方法对于基因扩增有很高的效率。

3.3 对海产品当中是否含有霍乱弧菌进行检测的结果使用建立起的LAMP方法来对选取的100份海产品进行了检测，其中有1份被检测出霍乱弧菌呈现阳性（检出概率为1%），这一结果和通过采用SN/T1022—2010标准方法的检测结果保持一致，具体情况见表4。

表4 含有ctxA基因的海产品进行检测后的结果对比

经过总结对比，说明LAMP检测法是可靠的。

4 讨论分析

经过本文的研究和分析，说明LAMP检测法是可靠的。在当前的技术水平环境下，大部分建立起的LAMP检测法只能使用在糖凝胶电泳当中进行结果判定，存在比较严重的安全隐患。同时，由于缺少对实时反应的监控能力，因此很难对假阳性以及非特殊反应的干扰因素进行准确的排除，导致检测结果不准确。本文借助实时浑浊仪来具体分析LAMP反应的实际结果，能够直观地对反应进行观察，并且可以借助设置分析排除一些曾经无法进行排除的干扰因素。

对引物进行合理的优化和适当的筛选能够在短时间内进行准确的预测，本次研究借助LAMP研究技术对霍乱弧菌ctxA基因序列进行了一次完整的设计，并且得到了3组具有特殊性的引物，在LAMP扩增的结果当中明显地显示出来，这3组引物都能够在ctxA基因的检测当中进行使用，通过进一步的筛选之后，最终选择了A组作为本次研究的最优组。

在本次LAMP高效率的反应中，对目的序列进行一定扩增，并且让其达到了一定的临界值之后，将会进入到一个高反应速率的阶段当中，并且反应峰值也达到了一定高度，对模板进行稀释只会对反应开始点的具体出现时间产生一定影响，并不会影响到整体反应的速度。在本次研究当中，稀释到一定程度，花费了比较长的时间，这和反应起始的时候DNA的模板总量有所关联，但是在扩增的产物量到达了临界值之后，却只花费了4min就达到了反应最高峰值，并且和其他的反应样本达到的峰值基本一致，也说明这一方法具有极高的扩增速度。

在本次研究当中，建立起的霍乱弧菌浊度LAMP检测法作用于全部的菌株之后，除了致病性霍乱弧菌之外，其他的菌株都呈现了明显的阴性，说明使用的A组引物拥有针对霍乱弧菌高度的特异性以及敏感性。借助这一检测方法，对选取的100份海产品进行了检测，并且和采用SN/T 1022—2010中方法所检测的结果进行了对比，得到了同样的1%检出概率，二者保持完全一致。但是根据研究前调查，传统检测办法从对海产品的样本收集开始算起，到最终得到完整准确的检测结果都花费了5 d～10 d，甚至更久，但是检测法却仅仅花费了1 d时间，这对于需要高效率的检测行业来说具有极大的优势。

5 结语

研究结果表明，在对海水产品进行养殖的过程中，绝对不能放松对霍乱弧菌进行检测和控制的力度，必须建立起具有高度时效性以及高度敏感性的检测判断方法，借此大大降低对该细菌检测花费的时间，进而尽可能降低其对养殖业的伤害以及对人们的身体健康乃至于生命安全的威胁。LAMP检测法不但操作简便，结果也十分可靠，因此可以进行更广泛地推广和使用。

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App lication of real-time turbidity LAMP test on vibrio cholera in seafood

LIANGHuali*
（Shanwei entry-exit inspection and quarantine bureau，Guangdong Shanwei 516600，China）

为了建立起一种同时具备快速、特殊、敏感以及有效的对霍乱弧菌进行检测的办法，并且借此来控制或预防该细菌造成大面积感染的可能性，对这种实际存在的霍乱弧菌中存在的ctxA基因所拥有的保守区域进行引物设计，通过实时浊度仪来进行LAMP检测，即环介导等温扩增研究法，对其所具备的特性以及敏感性进行研究分析，并且通过这一方法对极高可能存在海产品中的霍乱弧菌进行检测。

海产品；霍乱弧菌；实时浊度；LAMP检测

In order tocreate a rapid,specific,sensitive and effective detection ofvibriocholera,and thereby to control or prevent extensive infection caused by the bacteria,the conservative area of ctxA gene that exist in the vibrio cholerae have were primer designed,and LAMP detection was done by real-time turbidity instrument,named ring mediated isothermal amplification method.Its characteristics and sensitivity analysis were studied,and through the method the vibriocholera with high existence in seafood was detected.

seafood；vibrio cholerae；real-time turbidity；LAMP test

TS207.4

A

1673-6044（2015）04-0025-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2015.04.008

*梁华丽，女，1982年出生，2004年毕业于湛江海洋大学水产养殖专业，助理工程师。

2015-09-11