不同来源乳酸菌对2种致病菌的抑菌活性比较及抑菌性质研究*

任大勇 荣凤君 宫圣洁 张振业 朱剑威 刘宏妍 于寒松

1（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）2（吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118）

不同来源乳酸菌对2种致病菌的抑菌活性比较及抑菌性质研究*

任大勇1**荣凤君1宫圣洁1张振业1朱剑威1刘宏妍2于寒松1

1（吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春130118）2（吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118）

乳酸菌是指发酵糖类主要产物为乳酸的一类革兰氏阳性菌，不产生芽孢，过氧化氢酶阴性细菌的总称。乳酸菌是益生菌的重要组成部分，担负着机体多种重要的生理功能，并在肠道内发挥益生功能，增强机体的免疫力和抵抗力，促进肠道的生长和发育，是广泛应用的益生菌之一。乳酸菌以其独特的生物学功能呈现出极大的开发、利用价值，在农业、工业、食品及医疗保健等与人类密切相关的领域中有很高的应用价值。沙门氏菌、金黄色葡萄球菌能引起食物中毒和食品污染，是食源性疾病的常见细菌，这一问题得到了广泛关注。

抗生素给人类带来巨大的经济效益同时，在人的身体里也有耐药性、抗药性、残留等副作用，影响了机体的微生态平衡。目前许多研究表明，乳酸菌能产生类似抗生素的物质，能有效抑制有害微生物的生长，增加胃肠道内有益微生物数量，有可能成为潜在的抗生素替代品。本试验研究其对食品中常见致病菌的抑制作用，最终筛选出抑菌效果较好的乳酸菌菌株。

1 材料与方法

1.1 乳酸菌菌株来源

本试验乳酸菌菌株来源如表1所示。

表1 乳酸菌菌株来源

以上菌种由吉林农业大学食品科学与工程学院毒理学实验室分离并保存。

1.2 致病菌菌株

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium），由吉林农业大学食品科学与工程学院毒理学试验室分离并保存。

1.3 试验试剂

MRS液体培养基：蛋白胨10.0 g、葡萄糖20.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、吐温-80 1.0 mL、磷酸氢二钾2.0 g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.58 g、硫酸锰0.25 g、蒸馏水1 000 mL（加12.0 g琼脂为固体培养基）。

BL培养基：胰蛋白胨10.0 g、酵母浸出物5.0 g、氯化钠10.0 g、琼脂9.0 g、蒸馏水1 000 mL。

氢氧化钠，北京化工厂；过氧化氢酶，上海索莱宝生物科技有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶，中国慧世生化试剂有限公司；青霉素；乳酸链球菌素（NiSin）。

1.4 试验仪器

台式离心机，上海安亭科学仪器厂制造；电热恒温培养箱，湖北省黄石市医疗器械厂；电子天平，上海佑科仪器表有限公司；Delta320 pH计，梅特勒托利多仪器(上海)有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；KYC-100B空气恒温摇床，上海新苗医疗器械制造有限公司；净化工作台，上海新苗医疗器械制造有限公司；镊子；牛津杯；10 mL离心管；1.5 mLEp管；培养皿。

1.5 试验方法

1.5.1 上清液

取2 mL活化好的乳酸菌培养液，在4℃条件下，以12 000 r/min离心10 min，取上清液，进行抑菌试验。取3 mL乳酸菌菌液以12 000 r/min离心10min后，取乳酸菌的上清液，在37℃水浴加热2h后，用1 mol/L NaOH把菌株上清液的pH值调为6.5，然后用于抑菌试验。

1.5.2 乳酸菌菌体的获取

取4 mL活化好的乳酸菌菌液，以8 000 r/min离心2 min后，将上清液弃去，用蒸馏水洗涤1次，8 000 r/min离心2 min后，将上清液弃去，向剩余菌体中加入300 μL的蒸馏水吹匀，使浓度达到1×109cfu/mL，用于抑菌试验。

1.5.3 超声破碎菌体的获取

取3 mL活化好的乳酸菌菌液，使浓度达到1×109cfu/mL，8 000 r/min离心2 min，将上清液弃去，剩余菌体用蒸馏水连续洗涤2次，8 000 r/min离心2 min，将上清液弃去，向剩余菌体中加入3 mL的蒸馏水吹匀，进行超声波细胞破碎，破碎后离心取上清液，用于抑菌试验。

1.5.4 阳性对照药品

青霉素和乳酸链球菌素（NiSin）做阳性对照组。用质量浓度0.9%生理盐水将病原菌稀释至10-6cfu/mL浓度，取100 μL病原菌稀释液接种于LB固体培养基上，并涂布均匀。用镊子夹取高压灭菌后的牛津杯放到LB培养基上，每个平板贴5～6个牛津杯，分别吸取100 μL乳酸菌上清液加于牛津杯中，在超净工作台中静放5 min～10 min。静放后将平板放于37℃恒温培养箱培养12 h后，观察是否有抑菌圈，及其直径大小，从而比较各菌株菌体和产物的抑菌效果。

2 结果分析

9株乳酸菌对金黄色葡萄球菌和沙氏门菌的抑菌效果如表2所示。

表2 9株乳酸菌对2种致病菌的抑菌效果 cm

2.19 株乳酸菌对金黄色葡萄球菌的影响

由表2可知9株乳酸菌经过处理后对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌圈直径。乳酸菌上清液抑菌性最好的是H9，直径是2.56 cm；抑菌效果弱的是T20，抑菌圈只有1.37 cm。当把上清液pH调到6.5时，只有L12处理后的菌液对金黄色葡萄球菌还有抑菌效果，抑菌直径为1.26 cm，见下页图1。经过超声波破碎后，还有抑菌性的菌株是H8、H9、L2抑菌效果几乎差不多，其中最好的是L2菌株，抑菌圈直径是1.27 cm；直径最小的是T18，抑菌直径为0.94 cm。把菌株经过2次PBS缓冲液洗涤之后，只有T18菌体对致病菌没有抑菌效果，其余5株都有抑菌效果，抑菌效果最好的是H8，直径为1.63 cm，见下页图2。

2.29 株乳酸菌对鼠伤寒沙门氏菌的影响

根据表2可知9株乳酸菌经过处理后对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的抑菌圈直径。T18、L16、L17乳酸菌菌株的上清液抑菌效果比较接近，直径大约都在2.46 cm～2.54 cm左右；当把上清液pH调到6.5时，T18、L17、L34还有抑菌效果，抑菌性效果最强的是L17，抑菌直径为1.47 cm，见下页图3；经超声波破碎后，抑菌效果较好的菌株是L17，直径是1.27 cm之间，见图3；把9株乳酸菌进行PBS缓冲液洗涤2次之后，活菌体还具有抑菌效果，抑菌活性较好的是L16，抑菌圈的直径是2.04 cm，见下页图4。

3 讨论

在抗生素滥用的今天，寻找天然抗生素，已经成为人们研究的方向。天然抗生素在机体内不会残留、产生耐药和抗药性，同时还可以抑制胃肠道内有害微生物的生长，保护机体的微生态平衡。试验结果表明，不同家庭自制发酵食品中分离出的乳酸菌，其代谢产物、活菌体、超声波裂解物对致病菌都有抑菌效果，不同菌株在不同条件下对致病菌的抑菌作用也不相同。

图1 菌株L12对金黄色葡萄球菌抑菌圈

图2 菌株H8对金黄色葡萄菌抑菌圈

图3 菌株L17对鼠伤寒沙门氏菌抑菌圈

图4 菌株L16对鼠伤寒沙门氏菌抑菌圈

目前，国内外有很多研究人员对乳酸菌的抑菌活性进行了研究。周伟等报道了植物乳杆菌素L-1对单核细胞增生李斯特菌作用机制的研究。魏新元等报道了3株食用乳酸菌对抗生素的药敏性的研究。Sgouras D等报道了体外和体内抑制幽门螺旋杆菌的干酪乳杆菌菌株的活化的研究。侯亚文等报道了产细菌素乳酸菌筛选方法的研究进展的研究。陈静等报道了泡菜中乳酸菌的分离及其发酵液抑菌活性研究。乳酸菌的抑菌效果体现在多方面，不同来源的乳酸菌产生抑菌效果的原因也不相同。乳酸菌代谢后的产物，如乙酸、过氧化氢、抗生素类或细菌素类物质都具有抑菌作用。

本试验把9株乳酸菌上清液的pH值均调到6.5，菌液还具有抑菌效果，说明乳酸菌的代谢物中不只含有乳酸，还含有细菌素类物质进行抑菌；把乳酸菌菌体进行2次洗涤后，活菌体仍然具有抑菌效果，推测乳酸菌菌体表面有抑菌物质的存在；经超声波裂解后还具有抑菌效果，推测菌体内部含有抑菌物质或菌体表面的抑菌物质经过超声破碎、离心之后在上清液中产生抑菌效果。后续将会对细菌素类物质和活菌体进行深入研究，以期为今后乳酸菌的开发应用提供参考。

［1］段宇珩，谈重芳，王雁萍，等.乳酸菌鉴定方法在食品工业中的应用及研究进展［J］.食品工业科技，2007，28（2）：242-244.

［2］RODRIGUEZ-PALACLOS A，STAEMPFLI HR，DUFFIELD T，et al.Isolation of bovine intestinal Lactobacillus plantarum and Pediococcus acidilactici with inhibitory activity against Escherichia coli O157 and F5.［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，106（2）：393-401.

［3］SUN P，WANG J Q，ZHANG H T.Effects of supplementation of bacillus subtilis natto Na and N1 strains on rumen development in dairy calves［J］.Animal Feed Science& Technology，2011，164（3）：154-160

［4］章文明，汪海峰，刘建新.乳酸杆菌益生作用机制的研究进展［J］.动物营养学报，2012，24（3）：389-396.

［5］郭松年，田淑梅，白洪涛.乳酸菌及乳酸菌发酵食品［J］.粮食与食品工业，2005，12（1）：39-40.

［6］BACKHED F，LEY R E，SONNENBURG J L，et al. Host-bacterial mutualism in the human Intestine［J］. Science，2005，307（5 717）：1 915-1 920.

［7］PEDRON T，SANSONETTI P.Commensals，bacterial pathogens and intestinal inflammation：an intriguing menage a trois［J］.Cell Host&Microbe，2008，3：344-347.

［8］马艳，常志州，朱万宝，等.饲用益生菌对抗生素敏感性的试验研究［J］.江苏农业科学，2002（5）：50-52.

［9］罗慧，杨勇，于洪意.益生素作用机理及其在现代畜牧生产中的应用［J］.中国畜牧兽医，2008，35（3）：17-20.

［10］高荣琨.乳酸菌体外抑菌试验报告［J］.当代畜牧，2007（12）：19-20.

［11］赵鑫锐，张书祥.产广谱乳酸菌素菌株的选育、鉴定及其发酵特性研究［J］.工业微生物，2010，40（6）：49-54.

［12］周伟，刘国荣，李平兰，等.植物乳杆菌素L-1对单核细胞增生李斯特氏菌作用机理的研究［J］.微生物学报，2007，47（2）：260-264.

［13］魏新元，张新颖，赵艳茹.三株食用乳酸菌对抗生素的药敏性研究［J］.食品工业科技，2010（9）：166-167.

［14］SGOURAS D，MARAGKOUDAKIS P，PETRAKI K，et al. In vitro and In vivo inhibition of helicobacter pylori by lactobacillus casei strain shirota［J］.Applied&Environmental Microbiology，2004，70（1）：518-526.

［15］侯亚文，易华西，杨艳艳，等.产细菌素乳酸菌筛选方法的研究进展［J］.食品与发酵工业，2013，39（3）：129-133.

Antibacterialproperties of lactic acid bacteria from different sources against two pathogens*

RENDayong1**RONGFengjun1GONGShengjie1ZHANGZhenye1ZHU Jianwei1LIUHongyan2YUHansong1

1（College of food science and engineering，Jilin agricultural university，Jilin Changchun 130118，China）

2（College ofChinese herbal medicine，Jilin agricultural university，Jilin Changchun 130118，China）

天然抗生素已经成为现代生物科学和食品科学关注的热点，筛选出含有抑菌物质的天然抗生素菌株，已经成为食品、生物研究的新趋势。选用9株不同来源的乳酸菌对2种致病菌进行体外抑菌试验，采用牛津杯法对乳酸菌的上清液、上清液（pH=6.5）、超声波裂解液、活菌体的抑菌性能进行研究。试验结果表明，当致病菌为金黄色葡萄球菌时：上清液抑菌最好的菌株是H9，直径为2.56 cm；上清液（pH=6.5）抑菌最好的是L12，直径为1.26 cm；活菌体抑菌最好的菌株H8，直径为1.63 cm；超声波裂解液抑菌最好的是L2，直径是1.27 cm。当致病菌为沙门氏菌时：上清液抑菌最好的菌株是L16，直径为2.54 cm；上清液（pH=6.5）抑菌最好的是L17，直径为1.47 cm；活菌体抑菌最好的菌株L17，直径为1.27 cm；超声波裂解液抑菌最好的是L16，直径是2.04 cm。

乳酸菌；抑菌；牛津杯法；病原菌

Natural antibiotics have become a hot topic in modern biological science and food science,screening of the natural antibiotic strains containing antimicrobial substances is a new trend in food and biological research.9 strains of lactic acid bacteria from different sources for 2 kinds ofpathogenic bacteria in vitrobacteriostasis experiment was carried out.Oxford cup method was used to vitro antibacterial test in the supernatant of lactic acid bacteria,the supernatant（pH=6.5），the ultrasonic cracking and the live bacteria.The results show that pathogenic bacteria is Staphylococcus aureus,the best antibacterial strain of the supernatant,supernatant（pH=6.5），Live bacteria and Ultrasonic cracking liquid respectively is H9,L12,H8,L2.Above the best diameter respectively is 2.56 cm,1.26 cm,1.63 cm,1.27 cm. Pathogenic bacteria is Salmonella,the best antibacterial strain of the supernatant,supernatant（pH=6.5），Live bacteria and Ultrasonic cracking liquid respectively is L16,L17,L17,L16.Above the best diameter respectively is 2.54 cm,1.47 cm,1.27 cm,1.42 cm.

lactobacillus；antibacterial experiment；oxford cup method；pathogenic bacteria

TS261.1+7

A

1673-6044（2015）04-0041-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2015.04.012

吉林省教育厅项目［吉教科合字（2015）第196号］。

**任大勇，男，1979年出生，2013年毕业于吉林大学食品安全专业，博士，副教授。

2015-10-10