一种发酵乳中乳酸菌总数快速检测技术的研究

富鑫，华家才，储小军

（贝因美婴童食品股份有限公司，配方奶粉研发中心，浙江杭州310000）

一种发酵乳中乳酸菌总数快速检测技术的研究

富鑫，华家才，储小军

（贝因美婴童食品股份有限公司，配方奶粉研发中心，浙江杭州310000）

以还原法为理论基础，开发并建立一种应用于发酵乳饮料成品乳酸菌数指标的快速检测方法。本方法应用仪器记录了样品加入反应试剂后的颜色变化（RGB），通过数理统计分析，采用斜率法，以R值斜率表示样品颜色的变化速度。本研究对发酵乳样品进行了预处理，以符合刃天青还原法的反应条件。以GB 4789.35《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》为标准，建立了R值斜率与乳酸菌菌落总数之间的标准方程，经验证本方法检测结果与GB 4789.35《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》检测结果无显著差异。与现有标准方法相比，在时效性、运营成本等方面具有较大优势。

还原法；发酵乳；乳酸菌总数；快速检测

发酵乳在GB 19302-2010中的定义为以生牛（羊）乳或乳粉为原料，经杀菌、发酵后制成的pH降低的产品，涵盖了发酵乳、酸乳、风味发酵乳、风味酸乳等产品。由于食用时发酵乳及发酵乳饮料中的活菌数需达到一定数量才能起到保健作用［1］，因此GB 19302-2010《食品安全国家标准发酵乳》中明确规定了发酵乳产品的乳酸菌限量：乳酸菌数≥1×106cfu/g（mL）［2］。由于发酵乳为全冷链运输和销售，GB 4789.35-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》方法不但需要专业人员操作，运行成本较高，而且48 h的检验周期，严重缩短了发酵乳产品原本就很短的货架期。因此一种快速有效的发酵乳中乳酸菌数的检测方法，对缩短出厂检测时间，延长产品保质期内的货架摆放时间，进而提高企业利润和产品质量有着重要的意义。

本研究以染料还原法为理论基础。染料还原法是指通过向乳中加入某些氧化还原型染料，根据染料颜色变化速度来判定乳中细菌总数的多少，检测染料褪色时间的方法［3］。原理是氧化还原酶是微生物细胞内在代谢过程中由于生理需要产生主要酶类，在细胞内催化氧化还原反应［4］，能将微生物新陈代谢过程中从能量物质上脱下的氢传递给染料，使其还原并发生颜色变化。本研究选用刃天青为反应试剂，氧化还原酶与刃天青反应使刃天青由蓝色变为紫色、粉色直至无色。由于氧化还原酶数量与乳中存在的细菌数量存在一定的线性关系，因此可根据生乳的颜色变化可以对细菌总数进行判定与SPC法有很好的相关性（r=-0.79）［5］。

本研究采用自主研制的颜色信息采集仪器进行实验，试图建立一种快速、准确的新的检测发酵乳饮料成品乳酸菌数方法。如图1所示。

图1 实验仪器构造Fig.1 Schematic of the experimental instrument

仪器主要由LED发射器、感应器、微处理器等构成，采用RGB颜色体系采集信息，记录检测样品颜色变化。东北农业大学的相关研究中，对刃天青染料还原法的颜色变化对仪器的RGB颜色体系进行Exraction method：principal component analysis（主成分分析），确定以R值斜率为变量，记录刃天青颜色变化［6］。

乳酸菌并不是微生物学的分类，是一类能使可发酵性碳水化合物转化成乳酸的细菌的总称［7］。发酵乳由灭菌后的牛乳接种发酵剂经发酵制得［8］，因此发酵乳中的细菌总数即为乳酸菌数。而采用刃天青还原法测定发酵乳中乳酸菌数还需要对样品进行一些处理。这是由于发酵乳饮料的pH过低，不符合刃天青染料还原法的反应条件。pH对刃天青还原法的影响主要有两个方面：首先，pH是影响细菌生命代谢活动的主要因素，直接影响微生物代谢中的酶反应，动物酶的适宜反应pH在6.5～8.0之间［9］。另一方面，刃天青为氧化还原染料，本身可作为pH指示剂，酸性条件下呈红色，碱性条件下呈蓝色。当氢离子浓度高时，粉色的试卤灵浓度增加，溶液颜色将出现明显变化。当氢离子浓度很低，甚至是在碱性条件时，蓝色的刃天青难以得到氢离子生成试卤灵，从而变色反应收到明显的限制。东北农业大学的相关研究结果证明，应用刃天青染料还原法检测细菌总数，经多重比较大致在pH 6.5～7.0范围内检测结果无显著差异［10］。目前市售的合格发酵乳pH在4.0～4.5范围内，因此需要将发酵乳样品经处理后使其pH在6.5～7.0范围内，才能应用刃天青染料还原法对其乳酸菌总数进行快速检测。

以UHT乳对样品进行稀释的方法对发酵乳进行预处理，使其pH符合刃天青染料还原法的反应条件。以仪器记录结果及GB 4789.35检测结果建立标准曲线，并根据标准曲线计算发酵乳中乳酸菌数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生乳：黑龙江贝因美乳业有限公司提供；发酵乳：市售；UHT乳：市售；刃天青：Sigma公司；MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基：北京奥博星生物技术有限公司；梅特勒-托利多delta320 pH计：瑞士梅特勒-托利多有限公司；颜色信息采集仪器（自制）：可内置20个比色皿，测量温度37℃，CCD传感器采集样品颜色信息，每1 min采集一次，连续10 min，传输到计算机，检测结果以样品的三原色值（RGB值）显示，以Excel表格形式存储于计算机中。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理方法

随机抽取市售发酵乳样品10个，与UHT乳1∶9混合，pH计室温（15℃～20℃条件下）检测发酵乳样品pH和稀释后混合液pH。

1.2.2 标准曲线的建立与验证

本研究随机抽取市售样品17个，按照1.2.2方法对其进行预处理。将预处理后样品1 800 μL，加入0.005%（w/v）刃天青溶液200 μL于比色杯中混匀；将比色杯放入自制颜色信息采集仪器中进行检测，连续10 min采集样品RGB颜色信息，以R值斜率表示样品颜色的变化速度。以乳酸菌数为纵坐标，自制颜色信息采集仪器检测结果（R值斜率）为横坐标，绘制R值斜率与乳酸菌数之间的关系曲线，乳酸菌数为采用GB 4789.35对未经预处理的样品中的乳酸菌数的检测结果。应用Excel数据分析工具进行回归分析，得到回归方程、相关系数，分析其相关性，绘制标准曲线。另随机抽取12个市售发酵乳饮料样品进行标准曲线的验证，每组做3个平行。以X±x形式记录数据，进行相关性分析与t检验（双尾）。

2 结果与分析

2.1 样品预处理方法结果

样品预处理方法结果见表1。

表1 样品预处理后的pHTable 1 pH after sample pretreatment

由表1可以看出，发酵乳经UHT乳10倍稀释后，pH在6.5～6.9范围内，符合还原法反映条件，因此基于还原法建立发酵乳中乳酸菌总数的快速方法具有可行性。

2.2 标准曲线的建立

对17个市售发酵乳样品按照1.2.1方式处理后进行检测，同时通过标准平板计数法进行菌落计数。以生乳细菌菌落总数为纵坐标，生乳细菌总数检测仪检测结果（R值斜率）为横坐标，绘制R值斜率与菌落总数之间的关系曲线，结果见图2。

图2 R值斜率与乳酸菌数的关系曲线Fig.2 Relation between R slope andtotal lactic acid bacteria

本研究最终得到得到回归方程：y=1.463 7x-4.959 2（R2=0.897 9），式中：y为乳酸菌数，x为R值斜率。经F检验F=131.950＞F0.05（1.15）=4.54，即本研究方法获得的R值斜率检与GB 4789.35方法检测结果相关关系极显著。本研究以此方程作为标准方程，后续的测定中将本研究方法得出的R值斜率代入此方程，即可得到乳酸菌数。

2.3 验证试验结果

为了验证标准曲线建立的合理性，采集市售发酵乳样品，应用本研究建立方法检测，计算R值斜率，根据回归方程计算出样品中的乳酸菌数，与GB 4789.35方法比较，结果见表2。

表2 刃天青还原法与GB 4789.35检测结果Table 2 Results of Reduction Reaction Method and GB 4789.35

将表2中刃天青还原法与GB 4789.35方法测定结果进行t-检验，结果见表3。

表3 t-检验结果Table 3 Result of t-test

由表3 t-检验结果可知，t Stat＜t（双尾临界），说明应用本研究所建立标准曲线计算的乳酸菌数与GB 4789.35方法检测结果差异不显著，所以本试验制作标准曲线较为准确。

3 讨论

1）本研究分析加入试剂后生乳颜色变化，通过斜率法计算R值斜率，建立了标准方程，实际测定中只需将检测结果R值斜率代入此方程，即可得到发酵乳中的乳酸菌数。

2）本方法的建立主要依据GB 19302-2010对发酵乳的定义，所以GB 19302-2010涉及的发酵乳、酸乳、风味发酵乳、风味酸乳等产品乳酸菌指标均可应用本研究方法判定。

3）由于不同发酵乳中菌种及其配比不尽相同而导致还原酶含量、活力的差异［11］，引起刃天青还原速度的差异，进而影响R值斜率，影响最终检测结果。

4）本研究所采集样本数量有限，但证明了建立的标准曲线样品颜色变化与发酵乳中乳酸菌数的正向相关趋势。更为准确的，可用于换算R值与乳酸菌数的数学模型，将通过在进一步的研究中扩大样本空间以及增大样本量来得以实现。

［1］Nathalie Klein，Athena Zouraia，Sylvie Lotal．Probiotic cell counts and acidification in fermented milks supplemented with milk protein hydrolysates［J］.International Dairy Journal，2002，12：853-861

［2］中华人民共和国卫生部.GB 19302-2010食品安全国家标准发酵乳［S］.北京：中国标准出版社，2010：3

［3］ Lemos E G M，Carareto-Alves L M.Short Communication：Resazurin Reducing Time As An Indicator Of Bradyrhizobium Viable Cell Count［J］.World Journal of Microbiology&Biotechnology. 1998，14：139-141

［4］戚中田.微生物学［M］.北京：科学出版社，2003：86-87

［5］Garcia A.R.，Prieto M.，Otero A.，et al..Assessment of the microbiological quality of raw ewes milk by rapid colorimetric methods［J］. Netherlands Milk and Dairy Journal，1994，48（2）：99-110

［6］富鑫，管勇佳，田波.生乳细菌总数检测仪测定生乳细菌总数的应用［J］.食品工业科技，2012（2）：70-72

［7］江汉湖.食品微生物学［M］.北京：中国农业出版社，2002：248-248

［8］张和平.张佳程.乳品工艺学［M］.北京：中国轻工业出版社，2007：195-204.

［9］池振明.微生物生态学［M］.山东：山东大学出版社1999：156-157

［10］富鑫.生乳细菌快速检测技术研究与设备开发［D］.哈尔滨：东北农业大学食品学院，2011：37-40

［11］武汉大学生物系微生物学教研室译.微生物学［M］.北京：科学出版社，1987：711-712

Research on a Rapid Detection Technology of Total Lactic Acid Bacteria in Fermented Milk

FU Xin，HUA Jia-cai，CHU Xiao-jun
（BeingmateBaby&Child Food Co.，Ltd.，Formula R&D Center，Hangzhou 310000，Zhejiang，China）

Based on the theory of REDOX reaction，develop and building a measure which applies to rapid test the total lactic acid bacteria in fermented milk.The method was testing continuously the color（RGB）of the milk samples which had been added reagents by instrument，and the rate of color change was showed as R slope by statistical analysis.This research suggested a method of sample pretreatment in order to fit for reduction reaction conditions As against The Standard Method （GB 4789.35National food safety standardFood microbiological examination：Lactic acid bacteria），a standard curve was established to show the relation between R slope and total plate count.It was no significant difference between the two results of total bacteria measure apparatus and The Standard Method （GB 4789.35National food safety standardFood microbiological examination：Lactic acid bacteria）.Comparing with The Standard Method，this method has some advantages in aspect of lower operating cost and timeliness.

reduction test；fermented milk；total lactic acid bacteria；rapid detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.036

2013-04-10

富鑫（1984—），男（汉），中级工程师，硕士研究生，研究方向：乳制品快速检测技术。