液质法同时测定婴幼儿乳粉中7种有毒及禁用物质残留

于晓瑾，王浩，杨红梅，郭启雷，史海良

（北京市海淀区产品质量监督检验所，国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

液质法同时测定婴幼儿乳粉中7种有毒及禁用物质残留

于晓瑾，王浩，杨红梅，郭启雷，史海良

（北京市海淀区产品质量监督检验所，国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

黄曲霉毒素M1、双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪是婴幼儿配方乳粉中可能存在的有毒及禁用物质。样品经过复溶后，采用含1%氨水的乙腈超声提取，使用MGⅢ-C18色谱柱，经梯度洗脱分离，用多反应监测正离子或负离子模式，可以一次性对婴幼儿配方乳粉中的7种有毒及禁用物质进行定性和定量测定。通过对100种市售婴幼儿配方奶粉进行分析，表明该方法可用于婴幼儿配方奶粉中黄曲霉毒素M1、双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪残留的同时测定。

婴幼儿配方乳粉；黄曲霉毒素M1；双酚A；醋酸甲孕酮；己烯雌酚；苯甲酸雌二醇；氯丙嗪；塞拉嗪

婴幼儿配方乳粉是以乳类及乳蛋白制品为主要原料，加入适量的维生素、矿物质和/或其他成分，仅用物理方法生产加工制成的液态或粉状产品，适于正常婴幼儿食用，其能量和营养成分能够满足婴幼儿的正常营养需要。

黄曲霉毒素M1是动物摄入黄曲霉毒素B1后在动物体内经羟基化形成的代谢产物，主要存在于动物的乳、肾脏、肝脏、蛋、肉和尿液中，其中以乳中最为常见。黄曲霉毒素M1具有剧毒性和致癌性，WHO将其列为ⅡB类致癌物，其性质相对稳定，在超高温牛奶中也能存在。长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝癌、胃癌、肠癌等疾病的主要原因。双酚A具有雌激素样活性，会造成人类内分泌、免疫、神经系统异常，还会严重干扰生殖遗传功能。双酚A常用来作为单体合成聚碳酸酯塑料，可用来加工成食品接触材料，材料中残留的双酚A会迁移到接触的食品中，袋装婴幼儿食品中有可能会由于包装中迁移含有双酚A残留。醋酸甲孕酮、苯甲酸雌二醇、己烯雌酚等雌性激素进入人体不仅可以导致与内分泌相关的肿瘤、出生缺陷和生育缺陷，还会对婴儿、青少年的生长发育造成严重影响，例如，现在儿童出现性早熟现象，就可能是和食物中性激素残留密切相关。氯丙嗪、塞拉嗪等药物由于其较强的毒副作用，国家规定其允许作治疗用，用于产奶动物的治疗，但不得在奶中检出。因此，为了保护广大婴幼儿的健康和利益，应及时建立简便、快速、准确、灵敏度高的婴幼儿配方乳粉中黄曲霉毒素M1、双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪残留的检测方法，用以保障婴幼儿配方乳粉的质量安全。

通过文献查阅获知，测定黄曲霉毒素M1、双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪的文献比较多，方法主要是酶联免疫法［1-2］、气质联用法［3-5］、液相色谱法［6-9］和液质联用法等［10-14］。由于酶联免疫法存在不能定性，假阳性等情况；气质联用法前处理步骤繁琐、试剂消耗量大、测定周期长；液相色谱法的检出限较高，且不能进行确证；液质联用技术是近年来新兴的检测技术，由于其的准确性、高效性和高灵敏度，符合食品安全检测快速高效的要求。

目前，乳粉中双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪还没有的相关的国家标准检测方法，也还鲜见液质联用法同时检测黄曲霉毒素M1、双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪残留的报道。本文中婴幼儿配方乳粉样品经过复溶后，采用含1%氨水的乙腈超声提取，采用高效液相色谱串联质谱仪进行检测，可以一次性对婴幼儿配方乳粉中的7种有毒及禁用物质进行定性和定量测定。

1 材料与方法

1.1 试剂

标准样品：黄曲霉毒素M1（纯度≥98%），双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪（纯度≥99%）：美国Sigma公司；甲醇和乙腈（色谱纯）：德国Fisher公司；其他试剂均为分析纯，国产。

1.2 仪器

Agilent 6410型串联三重四极杆质谱仪；Agilent1200型液相色谱仪；RE-2000型旋转蒸发器：上海市亚荣生化仪器厂；KQ-5200型超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；TGL-16M型高速台式冷冻离心机：湘仪离心机仪器有限公司；Milli-Q去离子水发生器：美国Milli-Q公司。

1.3 标准溶液

标准储备液：分别称取黄曲霉毒素M1、双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪标准样品2 mg（精确至0.1 mg），分别用甲醇溶解，定容至20 mL，配成0.1 mg/mL的标准储备液，放置于-18℃保存。

标准工作溶液：分别吸取1mL双酚A、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇的标准储备液于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成标准工作溶液，浓度分别为1 000 ng/mL。分别吸取0.1 mL黄曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、氯丙嗪、塞拉嗪的标准储备液于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成标准工作溶液，浓度分别为100 ng/mL。

1.4 样品前处理条件

准确称取5.0 g样品（精确至0.01 g），置于100 mL比色管中，用40 mL温水充分溶解后，再用1%氨水的乙腈溶液定容。超声提取20 min后，上清液经滤纸过滤，吸取25 mL滤液至100 mL蒸发瓶内，于45℃水浴旋转蒸发至1 mL左右，用2%氨水的甲醇溶液充分溶解后定容至5 mL，0.22 μm有机相滤膜过滤。

1.5 液相色谱条件

色谱条件：色谱柱，CAPCELL PAK MGⅢ-C18柱，1.8 μm，150 mm×2.1 mm（i.d.）；流速，0.25 mL/min；柱温，25℃；进样量，20 μL。

流动相体系：流动相A，甲醇；流动相B，10 mmoL/L乙酸铵缓冲溶液；梯度洗脱程序见表1。

1.6 质谱分析条件

离子源，电喷雾离子源（ESI）；扫描方式，黄曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、氯丙嗪、塞拉嗪、苯甲酸雌二醇为正离子模式，双酚A、己烯雌酚为负离子模式；检测方式，多反应检测；干燥气，N2；雾化气压力，275.8 kPa；干燥气温度，325℃；干燥气流速，8 L/min；汽化温度，340℃。

表1 液相色谱流动相梯度洗脱程序Table 1 HPLC mobile gradient elution program

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件选择

为了充分提取样品中7种目标化合物，分别选择了乙腈、甲醇、乙酸乙酯做为样品提取溶液，加标回收率均＜50%。随后发现含有1%氨水的乙腈能有效地提取样品中目标化合物，而且乙腈也可以有效的去除样品中的蛋白质，因此，选择1%氨水的乙腈作为样品提取液。此外，只有当定容溶液为碱性时，目标化合物才能充分溶解，因此选择含2%氨水的甲醇溶液作为定容溶液。

2.2 色谱条件的优化

色谱柱的选择：分别采用了CAPCELL PAK MGⅢ-C18色谱柱、ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱和ZORBAX SB-Aq色谱柱进行分离试验，发现CAPCELL PAK MGⅢ-C18色谱柱（1.8 μm，150 mm×2.1 mm）分离效果较好。

流动相的选择：黄曲霉毒素M1、双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪等7种化合物结构差异较大，且需要正负两种电离模式，因此采用10 mmoL/L乙酸铵溶液-甲醇为流动相，利用梯度洗脱的方法提高分离及检测效果效果。流动相10 mmoL/L乙酸铵溶液-甲醇的比例为80∶20，可以去除测定液中的杂质；15 min时改变比例为5∶95，可以洗脱出测定液中7种目标化合物。通过上述两步梯度，在25 min内可以较好的分离黄曲霉毒素M1等7种目标化合物。

2.3 质谱条件的优化

采用直接进样方式将标准工作溶液注入离子源中，在负离子检测方式下进行母离子全扫描，得到双酚A和己烯雌酚的分子离子峰，在正离子检测方式下进行母离子全扫描，得到黄曲霉毒素M1、醋酸甲孕酮、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪、塞拉嗪的分子离子峰。根据欧盟2002/657/EC指令规定，质谱确证方法必须达到4个确证点，应在确定母离子的基础上选择2个以上的子离子。以该离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，采集全扫描的二级质谱图，得到碎片离子信息，再对得到的二级质谱参数（如破碎电压、碰撞能量等）进行优化，使定性离子与定量离子产生的离子对强度比例达到最大，从而得到目标化合物的最佳质谱参数，结果见表2。

表2 7种化合物的质谱参数Table 2 Parameters of mass spctra of seven compounds

2.4 线性关系及检出限

用空白样品提取溶逐级稀释的标准工作液，获得不同浓度的标准样品溶液，依次进样测定，以目标化合物的峰面积为纵坐标，其对应的浓度为横坐标制作标准曲线，并计算线性方程和相关系数。同时用空白样品进行加标实验，根据信噪比s/N=3计算出方法的检出限，根据信噪比s/N=10计算出方法的定量限，结果见表3。

表3 7种化合物的线性方程、线性关系、相关系数、检出限及定量限Table 3 The linaer equation，correlation coefficient，limits of detection，LOQ for seven compounds

2.5 回收率和精密度

分3组准确称取空白样品6份，每份5.0 g，按照表4分别加入标准样品。按照前处理方法分别处理后，在相同条件下进行测定，结果见表5。

表4 7种标准样品添加浓度Table 4 The added concentration of seven standard samples

由表5可知，添加了不同浓度的样品的加标回收率介于76.7%～102.9%之间，平均相对标准偏差为1.29%～8.83%（n=6）。空白样品中添加7种化合物的MRM色谱图见图1。

表5 加标样品回收率与相对标准偏差（n=6）Table 5 Recovery and relative standard deviation（RSD）of in spiled sample（n=6）

图1 空白样品中添加7种化合物的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of a blank sample spiled with seven compounds

3 实际样品分析及评价

利用建立的方法对市场销售的100种婴幼儿配方乳粉进行检测，结果显示仅有一个样品中含有黄曲霉毒素M1（浓度为0.31 μg/kg），两种含有双酚A（浓度分别为5.1 μg/kg和5.6 μg/kg），其余样品中7种目标物质均未检出。黄曲霉毒素M1的污染来源是饲料，对市面上的奶粉检测并仅检出黄曲霉毒素M1一例，可以推断我国饲料质量稳定，未有劣质饲料真菌污染的现象；其次由于国家对婴幼儿乳粉的监控，使得企业对饲料质量、成品检测建立了规范流程，有效控制了黄曲霉毒素M1的产生。中国卫生部自2011年6月1日起宣布，禁止双酚A用于婴幼儿食品容器的生产和进口，有效控制了双酚A在婴幼儿乳粉中的迁移。氯丙嗪、醋酸甲孕酮、塞拉嗪、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇均为兽药，100个样品均未检出以上物质，可见兽药物质的使用和管理已经逐步规范。

近几年我国婴幼儿配方食品的质量管理比较严格，从2009年国家食品安全法出台以后，国家质检总局又在2010年发布了《关于企业生产婴幼儿配方奶粉许可条件审查细则和企业生产乳制品许可条件审查细则》，2011年国家工商总局又下发了《关于进一步与规范流通环节乳制品市场主体准入有关工作的通知》，之后国务院办公厅又下发了《关于严厉打击非法食品添加行为，切实加强食品添加剂监管的通知》。相关法规频频出台，为整顿婴幼儿乳粉市场，保障婴幼儿乳粉安全起到了至关重要的作用。在国家质检总局2010年发布生产婴幼儿配方奶粉许可条件审查细则后，对婴幼儿乳粉的生产企业重新进行了的生产许可申请审核，提高了婴幼儿乳粉行业的准入门槛，从企业设施等基本生产条件的角度为婴幼儿乳粉质量安全提供了基本保证。

4 结论

建立了婴幼儿配方乳粉中黄曲霉毒素M1、双酚A、醋酸甲孕酮、己烯雌酚、苯甲酸雌二醇、氯丙嗪和塞拉嗪的液相色谱-质谱测定方法。该方法样品加标回收率为76.7%～102.9%，平均相对标准偏差为1.29%～8.83%（n=6）。并利用该方法对市场销售的100种婴幼儿配方乳粉中7种有毒及禁用物质残留情况进行检测，检测结果表明该方法的灵敏度和准确度均满足实际样品检测的需要。

［1］高艳兵，叶绍辉，龚振明.醋酸甲孕酮（MPA）间接竞争ELISA检测方法的建立［J］.中国畜牧兽医，2007，34（10）：124-126

［2］裴世春，肖理文.基于HRP标记抗体的黄曲霉毒素M1的直接竞争-ELISA快速检测方法［J］.食品科学，2011，32（18）：221-224

［3］吕刚，王利兵，刘军，等.包装材料中的份类环境雌激素的测定-固相萃取/气相色谱质谱法［J］.分析实验室，2008，27（9）：73-75

［4］雅韵，徐晓云，谢孟峡，等.动物组织中己烯雌酚残留的基体固相扩散-气相色谱-质谱分析方法研究［J］.分析化学，2003，31（11）：1356-1359

［5］卫碧文，缪俊文，于文佳.气相色谱-质谱法分析食品包装材料中双酚A［J］.分析实验室，2009，28（1）：107-109

［6］周建科，张前莉，韩康，等.中老年奶粉中双酚A和乙烯雌酚的反相高效液相色谱测定［J］.食品工业科技，2007，28（2）：233-234

［7］刘宏程，邹艳红，黎其万，等.高效液相色谱分离牛奶中己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚［J］.分析化学，2008，36（2）：245-248

［8］林维宣，李继业，田苗.单克隆免疫亲和柱-高效液相色谱法测定牛乳中黄曲霉毒素M1［J］.中国乳品工业，2000，28（6）：24-26

［9］李佐卿，章再婷，谢东华，等.免疫亲和柱高效液相色谱法快速测定牛奶和奶粉中黄曲霉毒素M1、B1、B2、G1、G2［J］.理化检验-化学分册，2005，41（6）：406-408

［10］杜志峰，黄金凤，郭新东，等.动物肌肉组织中己烯雌酚残留量的液相色谱-串联质谱法测定［J］.分析测试学报，2007，26（6）：823-826

［11］闫小峰，孙志文.超高效液相色谱-串联质谱法测定饲料中的己烯雌酚［J］.饲料广角，2010（11）：38-40

［12］王全林，张爱芝，陈立仁.超高效液相色谱-串联质谱法对奶制品中苯甲酸雌二醇残留的测定［J］.分析测试学报，2007，26（6）：823-826

［13］齐士林，吴敏，严丽娟，等.超高效液相色谱-质谱对动物源食品中氯丙嗪、异丙嗪及其代谢物的测定［J］.分析测试学报，2009，28（6）：677-681

［14］尹江伟，刘红河，刘祖强，等.高效液相色谱-串联质谱法测定食品和饲料中醋酸甲孕酮［J］.中国卫生检验杂志，2009，19（11）：2470-2472

Simultaneous Determination of Seven Kinds of Toxic and Prohibited Substances Residues in Infant Milk Powder by LC-MS/MS

YU Xiao-jin，WANG Hao，YANG Hong-mei，GUO Qi-lei，SHI Hai-liang
（Beijing Haidian District Institute of Products Quality Supervision and Inspection，China National Food& safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Aflatoxin M1，bisphenol A，medroxyprogesterone acetate，diethylstilbestrol，estradiol benzoate，chlorpromazine and xylazine are toxic and prohibited substances maybe present in infant milk powder.The samples were reconstituted，were ultrasonic extracted with alkaline acetonitrile，the HPLC separation was carried out on a MGⅢ-C18column，with gradient elution.The detection of seven toxic and prohibited substances were carried out in the positive or negative multi-reaction monitoring（MRM）mode.The analysis results of one hundred commercially available infant milk powders can simultaneous determining the residues of aflatoxin M1，bisphenol A，medroxyprogesterone acetate，diethylstilbestrol，estradiol benzoate，chlorpromazine and xylazine in infant milk powder.

infant milk powder；aflatoxin M1；bisphenol A；medroxyprogesterone acetate；diethylstilbestrol；estradiol benzoate；chlorpromazine；xylazine

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.034

2014-04-28

于晓瑾（1982—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品工程。