RP-HPLC定量分析人工北虫草中3种核苷类有效成分

刘少静，刘银，张根，王小宁，杨黎彬

（西安医学院药学院，陕西西安710021）

RP-HPLC定量分析人工北虫草中3种核苷类有效成分

刘少静，刘银，张根，王小宁，杨黎彬*

（西安医学院药学院，陕西西安710021）

分析5个不同品种泰山人工北虫草中主要核苷类成分的含量并比较其差异。采用反相高效液相色谱（RPHPLC）法检测5个样品中尿苷、腺苷、虫草素的含量。色谱柱为Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-水（7∶93），流速1.0 mL/min，检测波长260 nm，柱温为室温。3种成分的进样量分别在5.4～540、5.2～520、5.0～500 μg/mL范围与各自峰面积积分值呈良好的线性关系（r分别为0.999 4、0.999 4、0.999 2）；平均回收率分别为97.83%、98.10%、98.41%，RSD分别为2.51%、1.46%、2.21%（n均为5）。5个品种泰山人工北虫草中主要核苷类成分含量有差异。该方法快速、准确、重现性好，能有效鉴别虫草的核苷类成分，可用于天然虫草和人工虫草中核苷类成分的分析，评价不同来源虫草的质量。

高效液相色谱法；北虫草；尿苷；腺苷；虫草素

冬虫夏草（Cordyceps）系麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌（Cordyceps sinensis［Berk.］Sacc.）寄生于鳞翅目蝙蝠蛾科（Hepialidae）昆虫幼虫上所形成的子座及幼虫尸体的复合体，是我国传统名贵中药。主要分布在我国青海、西藏、四川、云南等地海拔3000m～5100m的高寒草甸区。由于自然条件的限制和近年来过度的采挖，天然虫草资源已日益匮乏，现多用人工虫草如北虫草来满足市场的需求［1-2］。

北虫草在生物学分类上与冬虫夏草同为虫草属，其功效与野生冬虫夏草相近［3］。研究表明：其具有广泛药理活性，如抗肿瘤，调节肾功能，预防心脑血管疾病等。其中核苷类成分为虫草的主要活性成分之一［4］。据文献报道测定冬虫夏草中核苷类物质含量的方法主要有薄层色谱法（TLC）、高效液相色谱法（HPLC）和毛细管电泳法（CE）等［5-6］。为了考察不同产地天然虫草及人工虫草的质量，本研究建立了HPLC-UV定量分析5个品种北虫草样品中尿苷、腺苷及虫草素3种核苷类成分。这种质控标准的确立也为人工北虫草替代野生虫草资源提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DIONEX P680A型高效液相色谱仪：美国戴安公司；FA1004B电子天平（0.1 mg）：上海越平科学仪器有限公司；KQ5200E型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；L-550台式低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 试药

对照品：尿苷、腺苷、虫草素，中国药品生物制品检定所提供。

药材：1号～5号人工北虫草均由山东省莱芜市丰忠虫草研发种植基地莱芜市鼎盛宏利商贸有限公司鉴定提供。

试剂：甲醇为色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水溶液=7∶93；检测波长：260 nm；柱温：室温；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。色谱图见图1。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance and the sample

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液

分别精密称取尿苷、腺苷和虫草素对照品适量，加超纯水溶解并定容，制得尿苷、腺苷和虫草素浓度分别为540、520、500 μg/mL的混合对照品母液。精密吸取一定量母液，加超纯水定容配制成系列混合对照品溶液，其中尿苷浓度依次为：540、270、135、54、27、5.4 μg/mL；腺苷浓度依次为：520、260、130、52、26、5.2 μg/mL；虫草素浓度依次为：500、250、125、50、25、5 μg/m。4℃冷藏备用。

2.2.2 供试品溶液

分别精密称取过40目筛的1号～5号人工北虫草粉末各约1.0 g，置具塞锥形瓶中，加水10 mL，室温下超声提取30 min，取出放冷，过滤，将滤液定容至25 mL量瓶中，过0.45 μm滤膜，既得供试品溶液。

2.3 线性关系

精密吸取系列混合对照品溶液各10 μL，按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以对照品的进样浓度（x）为横坐标，相应峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，得到尿苷、腺苷及虫草素的回归方程及线性范围，结果见表1。

表1 3种成分的回归方程、相关系数与线性范围Table 1 Regression equation，correlation coefficient and linear range of three components

2.4 精密度试验

选取一个浓度下的混合对照品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，连续进样5次，测得尿苷、腺苷及虫草素峰面积积分值的RSD分别为0.46%、0.12%和0.62%，表明精密度良好。

2.5 重复性试验

精密称取同一供试样品（批号120405）5份，各约1.0 g，按照“2.2.2”项下方法制备5份样品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，分别进样10 μL，测得尿苷腺苷及虫草素峰面积的RSD分别为2.43%、1.87%和3.47%，结果表明，该方法重复性良好。

2.6 稳定性试验

对同一供试品溶液（批号120405），于0、2、4、6、8、10、12 h进样，测得尿苷、腺苷及虫草素峰面积的RSD分别为1.26%、2.03%和1.63%。表明，供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一样品（批号120405）粗粉5份，各约0.5 g，置具塞锥形瓶中。分别加入尿苷、腺苷及虫草素对照品适量，按照“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按照“2.1”项下色谱条件，进样分析。计算尿苷、腺苷及虫草素的平均回收率（n=5）分别为97.83%（RSD=2.51%），98.10%（RSD=1.46%）及98.41%（RSD=2.21%）。表明所采用的提取方法及色谱条件均具有较强的可靠性。

2.8 样品测定

取5批样品按照“2.2.2”项下操作，在“2.1”条件下，精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定尿苷、腺苷及虫草素峰面积，带入标准曲线方程，计算含量。结果见表3。

表35 批样品含量测定结果（%，n=3）Table 3 Result of content determination of 5 samples（%，n=3）

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

与HPLC-DAD及HPLC-MS方法相比，本研究采用HPLC-UV（HPLC分析中最常规的检测器）一次进样可将3种核苷类物质从基线处完全分开，达到准确定量分析冬虫夏草的主要核苷类有效成分的目的。在该试验中，采用甲醇-水作为流动相，为避免样品中杂质的干扰，经反复试验，确定甲醇-水最佳配比为7∶93。

3.2 提取工艺的优化

以尿苷、腺苷及虫草素3个目标成分的提取率为指标，综合考察提取溶剂、溶剂用量、超声时间等因素对试验结果的影响，结果发现以10倍量的水超声30 min即可基本提取完全。

3.3 含量测定结果表明，1号～5号人工北虫草中3种核苷类成分存在明显差异。如腺苷相差近10倍（批号120413为0.015 5%与批号120415为0.112 3%）。虫草素相差达5倍（批号120405为0.530 3%与批号120410为0.090 8%），这可能是由于品种不同导致。因此，该方法的建立为天然与人工虫草质量的深入研究和评价提供了有利的方法和依据，同时这种质控标准的确立也为人工北虫草替代野生虫草资源提供参考。而《中国药典》将腺苷作为冬虫夏草的唯一质控指标，不能完整确切地反映冬虫夏草的质量，这一点还需要进一步研究。

［1］梁洪卉，程舟，杨晓伶，等.HPLC定量分析冬虫夏草的主要核苷类有效成分［J］.中药材，2008，31（1）：58-60

［2］雷宁，杜树山，倪雪梅，等.RP-HPLC测定天然虫草与人工虫草中核苷类成分的含量［J］.中国药学杂志，2006，41（12）：948-951

［3］陆巍杰，唐永范，高瑞栋.HPLC法测定北冬虫夏草和常见食用菌中腺苷和虫草素［J］.现代药物与临床，2011，26（4）：313-315

［4］武为宝，唐军.皖产古尼虫草中核苷和碱基成分的HPLC分析［J］.药物分析杂志，2011，31（9）：1668-1671

［5］LI S P，LI P，ZHANG P，et al.The contents and their change of nucleosides from natural Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps mycelia［J］.Acta Pharm Sin，2001，36（6）：436-439

［6］黄海燕，钟建理，谢黔锋，等.冬虫夏草质量控制方法研究概况［J］.中国药业，2010，19（9）：88-90

Determination of Nucleosides in Cultured Cordyceps by RP-HPLC

LIU Shao-jing，LIU Yin，ZHANG Gen，WANG Xiao-ning，YANG Li-bin*
（Xi'an Medical University，College of Pharmacy，Xi'an 710021，Shaanxi，China）

To develop a HPLC method for the determination of the nucleosids from cultured Cordyceps，and to study the difference in them.Five samples of Cordycep from different resources were collected.Uridine，adenosine and cordycepin were determined by RP-HPLC method.The separation was performed on a Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）with UV detection at 260 nm，the mobile phase consisted of methanol-water（7∶93），the flow rate was 1.0 mL/min and the columm temperature was controlled at room temperature.The linear range of uridine，adenosine and cordycepin were 5.4 μg/mL-540 μg/mL（r=0.999 4），5.2 μg/mL-520 μg/mL（r=0.999 4），5.0 μg/mL-500 μg/mL（r=0.999 2），respectively.The mean recovery of three components were 97.83%（RSD=2.51%，n=5），98.10%（RSD=1.46%，n=5），98.41%（RSD=2.21%，n=5），respectively.The contents of nucleosides in 5 cultured Cordyceps were different from one another.The method is quick，accurate，reproducible and can effectively distinguish nucleosides in various Cordyceps.Consequently it can be used to analyze nucleosides between Cordyceps sinensis and cultured Cordyceps as well as evaluate their quality.

HPLC；codyceps mjilitaris；uridine；adenosine；cordycepin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.032

2013-12-29

刘少静（1984—），女（汉），讲师，硕士，主要从事天然产物研究与开发工作。

*通信作者：杨黎彬，男，副教授，博士，主要从事天然产物研究与开发工作。