植物蛋白酶提取柠檬皮果胶

韩鹏，黄雨欣，李雪梅，叶艳梅，宋丽洁，刘义武

（内江师范学院化学化工学院，四川内江641199）

植物蛋白酶提取柠檬皮果胶

韩鹏，黄雨欣，李雪梅，叶艳梅，宋丽洁，刘义武*

（内江师范学院化学化工学院，四川内江641199）

利用植物蛋白酶-醇析法对柠檬皮果胶的提取工艺进行研究。考察液料比、缓冲液pH、提取时间、提取温度、酶浓度对果胶得率的影响，采用单因素试验及正交试验得到柠檬皮果胶的最佳提取工艺条件：提取时间50 min，温度54℃，pH 7.0，加酶量3 mg/g，液料比20∶1。在此条件下进行了3次平行试验，在平行实验中其重现性很好，结果表明此工艺条件确实是稳定性良好的最佳工艺条件，果胶平均得率为27.60%。

植物蛋白酶；柠檬皮；正交试验；果胶

果胶是植物中的一种酸性多糖物质，它通常为白色至淡黄色粉末，稍带酸味，具有水溶性，其分子量约5万～30万，主要存在于植物的细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。柑桔、苹果、柠檬等果皮是果胶丰富的来源［1-2］。果胶是一种天然高分子化合物，具有良好的胶凝化和乳化稳定作用，其用途广泛，运用于食物、化妆品等各个领域［3-5］。

果胶提取的方法有：酸提取法、离子交换法、微波法、酶法和微生物法等［6-13］。其中酸提取法虽是工业提取果胶的主要手段，但酸提取法提取过程中果胶分子易发生部分水解和降解，这样降低了果胶分子量，影响果胶的收率和质量。而酶法就能克服这一缺陷。酶法提取果胶因酶作用的高效性和专一性，果胶收率高，生产工艺流程和设备简单，工艺易于控制，且能够更好地保持产品的胶凝度，目前酶解法提取果胶所用的酶主要有：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶，而植物蛋白酶却鲜有研究［11-13］。从柠檬皮中提取果胶可以使大量的柠檬皮渣得以充分且高附加值地利用，又解决了柠檬果皮污染环境的问题，对柠檬的综合利用和高效增值均具有十分重要的意义。所以，本文利用纯天然植物蛋白酶提取柠檬皮果胶，以期提高果胶质量，降低果胶生产成本。通过本研究可以推动酶法提取果胶的深入研究，为商业化生产提供更好的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菠萝蛋白酶（生物试剂）：上海金穗生物科技有限公司；柠檬酸，柠檬酸三钠，乙醇（均为分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；柠檬：四川安岳。

1.2 仪器与设备

TD5-I高速离心机：中国四川蜀科仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：中国郑州英峪予华仪器有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱：中国上海鸿都电子科技有限公司；JA5002电子天平：中国上海精天电子仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试验步骤

原料处理：将柠檬剔出果皮，并切成小块，将其在沸水灭活5 min，用蒸馏水洗涤至无色，60℃干燥，粉碎备用。

酶提取：以菠萝蛋白酶用量为2 mg/g，提取缓冲液pH为5.6，提取温度为45℃，提取时间45 min为基准条件进行单因素实验。

菠萝蛋白酶灭活：将溶液加热至95℃左右，酶灭活约5 min。

分离：离心分离，收集上清液，沉淀用等体积水洗涤，离心，合并上清液。

沉淀：离心后，降温，在搅拌下加入乙醇，直至果胶成海绵状完全沉淀出来。

提纯：抽滤后，用乙醇洗涤2次～3次，50℃干燥。

改变条件：菠萝蛋白酶用量为1 mg/g～9 mg/g；pH为3～7；提取时间15 min～120 min；温度35℃～60℃；料液比为1∶15～1∶40。

1.3.2 正交试验设计

参照单因素实验的结果，选择提取温度、提取时间、液料比、pH、酶添加量5个实验因素为研究对象，每项因素选择4个水平，选用L16（45）进行正交试验见表1。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels in orthogonal design

1.3.3 果胶含量的测定

果胶产品分析根据国家标准GB 25533－2010《食品添加剂果胶》中方法进行。

1.4 果胶得率的计算

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 植物蛋白酶浓度果胶得率的影响

加酶量对果胶得率影响的结果如图1所示。

图1 植物蛋白酶浓度对果胶得率的影响Fig.1 Effect of plant protease concentration on the extraction rate of pectin

采用1 mg/g～7 mg/g蛋白酶提取时，果胶得率随酶量的增加而增加，但继续当增加时，果胶得率则开始下降。这是因为酶用量低于7 mg/g时，酶解不彻底，释放出来的果胶含量较少，使得提取率低；当达到最佳值7 mg/g时，酶解进行的较彻底，当继续增加酶用量时，过量的酶使果胶进一步水解，生成的低分子量果胶增加，在过滤洗涤时会损失这部分［14］，使果胶得率降低。所以，7 mg/g为较佳酶浓度。

2.1.2 液料比对果胶得率的影响

液料比对果胶得率的影响见图2。

图2 液料比对果胶得率的影响Fig.2 Effect of ratio of raw liquid to material on the extraction rate of pectin

由图2可知，液料比增加使果胶得率整体呈现增加趋势，当液料比小于30∶1（mL/g）时，果胶的得率随液料比的增加而迅速增加。这是因为随着液料比的增加，酶在柠檬皮细胞内有更多的扩散空间，使其对细胞壁纤维素的分解能力增强，从而快速破坏细胞壁，果胶得以提取出来。当液料比大于30∶1时，果胶的得率趋于稳定，即继续增加溶液体积对果胶得率收益不大，且液料比大易造成浪费，投入工业生产成本增加。由此可确定30∶1为较佳液料比。

2.1.3 温度对果胶得率的影响

温度对果胶的提取影响比较大，有2个原因：一是高温能增加果胶溶出的传质动力，二是酶具有最适作用温度［1］。提取温度对柠檬皮果胶得率的影响见图3。

图3 温度对果胶得率的影响Fig.3 Effect of temperature on the extraction rate of pectin

由图3可知，果胶在25℃～60℃之间得率变化为：先增加再平缓后降低，主要原因是植物蛋白酶在45℃～55℃之间时活性较高［15］，温度过高或过低都会导致酶的活性下降，从而导致得率下降，因此酶的提取温度可选择在45℃～55℃之间。

2.1.4 提取时间对果胶得率的影响

提取时间对柠檬皮果胶提取率的影响见图4。

图4 提取时间对果胶得率的影响Fig.4 Effect of time on the extraction rate of pectin

由图4可知，随着时间的增加，果胶得率亦持续增加，但增加的速率亦呈现出逐步减小的趋势，90 min到120 min的果胶得率几乎无增加，因为随着时间的延长，蛋白酶活力能得到充分的发挥，酶解反应进行的就较为完全，果胶溶出的较充分［15］，因此提取时间大于90 min对果胶的提取无实际意义。综合考虑60 min左右为最佳提取时间。

2.1.5 缓冲液pH对果胶提取的影响

缓冲液pH对柠檬皮果胶得率的影响如图5。

图5 缓冲液pH对果胶得率的影响Fig.5 Effect of pH on the extraction rate of pectin

由图5可知，缓冲液pH在低于5时，果胶得率很低，表明植物蛋白酶在pH＜5时活性很低。pH从5.0到6.0可看出果胶得率迅速增加，这是因为在此pH条件下酶活性迅速增加；在6.0至7.0之间，得率较稳定，酶在此pH下活性最高［14］，故缓冲液pH在6.0至7.0之间最为合适。

2.2 植物蛋白酶提取柠檬皮果胶的正交试验

植物蛋白酶提取柠檬皮中果胶的正交试验结果及极差分析见表2。

表2 植物蛋白酶提取柠檬皮果胶的正交试验结果Table 2 Orthogonal experiments results of extraction lemon peel pectin by plant protease

由表2的极差分析可知5个因素对果胶得率影响的主次关系依次为液料比＞酶用量＞pH＞温度＞提取时间。果胶提取的最优组合为A4B3C2D4E2，即最佳组合条件为提取时间50 min，温度54℃，pH 7.0，酶用量3 mg/g，液料比20∶1。

2.3 最佳工艺条件验证

按2.2确定的最佳工艺条件：提取时间50 min、温度54℃、pH 7.0、酶用量3 mg/g、液料比20∶1进行3次平行实验，工艺重现性好，果胶平均得率为27.6%，高于正交试验中的所有组合，因此该工艺条件为最佳工艺条件。果胶纯度均达到国家标准，最佳工艺条件下果胶纯度为70%。

3 结论

本文研究了采用纯天然的植物蛋白酶提取柠檬皮中的果胶。通过单因素并结合正交试验，得出植物蛋白酶提取柠檬皮果胶的优化工艺为：液料比20∶1，蛋白酶用量3 mg/g，提取温度54℃，提取时间50 min。该工艺稳定可靠，产品符合国家食品安全标准。与其他酶法相比，采用从植物中提取的纯天然植物蛋白酶，用量少，而且价格便宜，且其果胶得率高，质量好，工业化应用前景十分广阔。

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Extraction Lemon Peel Pectin by Plant Protease

HAN Peng，HUANG Yu-xin，LI Xue-mei，YE Yan-mei，SONG Li-jie，LIU Yi-wu*
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Neijiang Normal University，Neijiang 641199，Sichuan China）

Lemon peel pectin was extracted by using plant protease-alcohol precipitation method.The effect of extraction parameters such as liquid material ratio，pH，extraction time，temperature，enzyme concentration on pectin yield was investigated.The optimal extraction conditions of lemon peel pectin was obtained by orthogonal experimentation on the basis of a series of single-factor experiments.The optimal conditions of extraction was extraction time 50 min，temperature 54℃，pH 7.0，the amount of enzyme 3 mg/g and the ratio of liquid to solid 20∶1.The average extraction rate of pectin was achieved 27.60%under the best conditions．

plant protease；lemon peel；orthogonal experimentation；pectin

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.014

2014-06-10

大学生创新创业训练计划项目（X201316）；四川省教育厅培育项目（12ZZ012，14CZ0025）

韩鹏（1993—），男（汉），在读本科，从事天然产物提取与分离。

*通信作者