荷叶盐渍和糖渍过程中苦涩味物质含量变化研究

刘雅颀，徐　梅，李　阳，周明全，王金华，胡中立，何建军，李冬生，汪　超，*

（1.湖北工业大学，湖北省食品发酵工程技术研究中心，协同创新中心，湖北武汉430068；2.武汉大学莲藕中心，湖北武汉430072；3.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉430068）

荷叶盐渍和糖渍过程中苦涩味物质含量变化研究

刘雅颀1，徐梅1，李阳1，周明全2，王金华1，胡中立2，何建军3，李冬生1，汪超1，*

（1.湖北工业大学，湖北省食品发酵工程技术研究中心，协同创新中心，湖北武汉430068；2.武汉大学莲藕中心，湖北武汉430072；3.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉430068）

对盐渍和糖渍处理过程中荷叶内的苦味和涩味代表物质-单宁和槲皮素含量进行动态监测，并结合感官实验对盐渍和糖渍处理过程中荷叶的苦味和涩味进行评定，结果显示：在盐渍和糖渍过程中，单宁和槲皮素的含量均有所下降。单宁含量分别下降了72.56%和71.15%；槲皮素的含量分别降低了29.79%和34.08%。荷叶碱含量上升，在盐渍和糖渍过程中分别增加了47.50%和76.14%。感官评价结果为，在盐渍15d，糖渍9d荷叶无明显苦涩味。荷叶盐渍15d和糖渍9d达到良好可食性。

荷叶，盐渍，糖渍，荷叶碱，槲皮素，单宁酸

荷叶（Nelumbo nucifera Gaertn）是睡莲科多年生水生草本植物莲，在我国资源丰富，分布广泛。荷叶是药食同源的植物，所有部位（根、茎、叶、花、种子）都具有极高的药用价值［1］。《本草纲目》记载其“生发元气，稗助脾胃，涩精浊散淤血，消肿痛，发痘疮”［2］；现代药理研究证明荷叶具有降脂、降压、抗心率失常、减肥等多种生理功能［3，17］。

荷叶中除蛋白质、糖类、脂类外，还含有大量单宁、黄酮类及生物碱等成分［1-5］。其中黄酮类物质含量较多的是味道极苦的槲皮素［6］；主要的生物碱是荷叶碱［4］。荷叶碱具有清除活性氧、抗菌、抗病毒作用［6］。单宁即鞣酸是多酚物质，主要有缩合单宁和水解单宁两种［7］。单宁与蛋白质反应产生涩味，是涩味主要来源［7］。

我国大量荷叶弃之不用，不仅没有有效的利用荷叶的价值，更不利于环保。近年来，荷叶多以减肥降脂产品的形式出现［8-11］，荷叶腌制产品则少有研究。荷叶因其苦涩对荷叶腌制产品有明显影响，且未见相关报道。本文通过确定盐渍和糖渍过程中槲皮素、单宁和荷叶碱含量的变化，探索其对苦涩味的影响。为后期研究苦涩机理和开发荷叶腌制品提供了理论基础。

1　实验与方法

1.1材料与仪器

荷叶于7月份采于湖北省农科院内，剪成1cm× 1cm的长条于-40℃冷冻保存，备用；精制食盐云鹤，食品级；Folin-Ciocalteu（FC）、Na2CO3、甲醇、乙醇、蔗糖购于中国国药公司，分析纯；荷叶碱标准品、槲皮素标准品购于中国绿叶药品公司，色谱纯；乙腈、甲醇购于中国国药，色谱级；单宁酸购于Sigma公司，分析纯。

UV-2450型可见光分光度计日本岛津；SPX-250B-Z型生化培养箱上海博讯实业有限公司医疗设备厂；KQ5200型超声萃取器昆山市超声仪器有限公司；TDL-40B型离心机上海安亭科学仪器厂；mini-1240型全程扫描分光光度计Shimadzu公司；LC-20AT型高效液相色谱仪C18column（250mm× 4.6mm），日本岛津。

1.2实验方法

1.2.1荷叶的盐渍取40.0g的荷叶条放入罐头瓶中，加入20.0%食用盐，盖紧盖子，至于95%恒温恒湿箱（30℃）中盐渍20d。每3d取样检测，平行3次。

1.2.2荷叶的糖渍取40.0g的荷叶条放入罐头瓶中，加入25.0%蔗糖，盖紧盖子，至于95%恒温恒湿箱（30℃）中，糖渍20d，每3d取样测定，平行3次。

1.2.3单宁测定

1.2.3.1单宁酸标准曲线的制作［12］准确配制3.0mg/mL的单宁酸标准溶液，分别吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL标准液于50.0mL容量瓶中，再各加1.0mL Folin-Denis显色剂，1.0mL 5%Na2CO3溶液，摇匀定容，室温静置30min后振荡，760nm比色，用0mL标准液的反应体系作参比，每个样品做3次平行测定，以平均吸光值与标准溶液的反应体系作线性，分析得到标准曲线。

1.2.3.2单宁的提取［12］准确称取10.0g荷叶，放在100.0mL的烧杯中，用100.0mL蒸馏水压榨。再将荷叶汁经频率为40kHz（150W）的超声波处理5min。用400m纱布过滤后再经8000r/min离心过滤。滤液定容至100.0mL。取0.5mL样液，1.0mL Folin-Ciocalteu（FC），1.0mL 5%Na2CO3，加水定容至25.0mL，30℃下水浴1h，于760nm测定吸光度。

1.2.4总黄酮的测定

1.2.4.1槲皮素标准曲线的制备槲皮素标准品用甲醇溶解，配制成浓度为2.0、4.0、8.0、10.0、20.0μg/mL的槲皮素标准液，用0.45μm的滤膜过滤，采用液相测定，条件为：色谱柱：C18（250mm×416mm×5μm）；柱温：25℃；流动相：甲醇∶0.4%醋酸（pH3）=68∶32；流速：1.00mL/min；波长：376nm。

1.2.4.2槲皮素的测定取4.0g样品研磨，用40.0mL甲醇溶解，经频率为40kHz（150W）的超声波萃取20min后，在10000r/min下离心10min，过滤取滤液备用，将滤渣用40.0mL的甲醇溶解，再经同样超声条件下萃取20min，重复以上步骤，将两次滤液合并，用甲醇定容至100mL。将样品溶液经0.45μm滤膜过滤，按照1.2.4.1中槲皮素液相条件进行测定，测定样品中槲皮素含量。

1.2.5荷叶碱的测定采取高效液相的方法测荷叶碱［13-15］。

1.2.5.1荷叶碱提取液的制备取10.0g样品，碾碎用30.0mL甲醇溶解。再放入频率为40kHz（150W）的超声波中萃取20min后，用10000r/min离心10min。过滤，取滤液。滤渣再用30.0mL甲醇溶解，再经同样超声条件下萃取20min，10000r/min离心10min后过滤取滤液。将两次滤液合并抽滤，并用甲醇定容到100mL容量瓶中。再用微孔滤膜（0.45μm）进行过滤。每隔3d取样进行测定。

1.2.5.2荷叶碱最大吸收波长的确定［14］将荷叶碱标准品溶于甲醇中，配制成浓度为15.0μg/mL的标准液。经分光光度计在200～700nm波长范围内进行扫描，以空白溶液为基准，测得荷叶生物碱最大吸收波长为270nm。

1.2.5.3荷叶碱标准曲线的制作分别配制荷叶碱浓度为3.0、4.0、10.0、12.0、15.0μg/mL标样溶液，均过0.45μm的微孔滤膜后备用。采用高效液相法测定荷叶碱含量［13］。

液相条件：色谱柱：Symmetry—C18（3.9mm× 150mm×5μm）；流动相：乙腈∶三乙胺（60∶40），三乙胺用乙酸调pH为7.00；流速：1.0mL/min；检测波长：270nm；柱温：30℃。

表1 感官评定表Table 1　Sensory evaluation

在上述色谱条件下，按荷叶碱峰高计算，理论塔板数应不低于5000，测定荷叶碱出峰时间为11.705min。

1.2.6感官评定选定10人作为评定小组成员，实验结果采用综合评分方法，确定荷叶苦味和涩味为考核指标，考核指标以100分制评定，综合评分满分为200分，评分按表1进行。

2　结果与讨论

2.1盐渍和糖渍过程中荷叶中单宁物质的变化趋势

2.1.1单宁酸标准曲线通过1.2.3.1得到单宁酸的标准曲线，回归方程为y（单宁酸）=1.4643x-0.017。其中，x表示单宁酸浓度（mg/L），y为吸光值。

2.1.2腌制荷叶中单宁变化趋势未经盐渍和糖渍的荷叶经测定其单宁含量高，为7.29μg/mL（单宁的测定数据误差范围为0.40μg/mL），质量分数为7.43%（表示：单宁物质质量占荷叶干重的百分比）。

图1　盐渍和糖渍过程中和荷叶中单宁酸变化Fig.1　The change trend of tannin in the process of pickled lotus leaf by salt and sugar

图1显示在盐渍过程中荷叶的单宁物质含量在逐渐减少。在0～9d盐渍过程中，荷叶中单宁物质大量减少。荷叶在盐渍前单宁含量为7.29μg/mL；盐渍第9d时，测定荷叶的单宁含量为2.66μg/mL。在盐渍第9d后，荷叶中单宁含量减少缓慢，逐渐趋于平缓。在盐渍第15d，测得荷叶中单宁浓度将为2.00μg/mL，和盐渍之前比较减低了72.56%。在荷叶糖渍的过程中前3d，单宁含量迅速下降至2.10μg/mL，后趋于平稳。单宁含量在糖渍过程比盐渍过程中下降迅速，且含量低于盐渍。盐渍和糖渍20d时，荷叶的单宁含量分别为2.00μg/mL和1.02μg/mL。可能由于糖可以与单宁结合，使得在盐渍和糖渍过程中荷叶的单宁含量减低［6］。糖渍中加入大量蔗糖，增加糖代谢，使得大量单宁与糖结合，降低荷叶中单宁含量。

2.2槲皮素含量变化

2.2.1槲皮素标准曲线按照1.2.4.1中液相条件进行样品处理可以得到良好的出峰效果如下图2，保留时间为5.608min，标准曲线为：y（槲皮素）=72486x+ 346031。x为样品浓度（μg/mL），y为峰面积，R2=0.9998。结果表明，在2～22μg/mL浓度范围内和峰面积有良好的线性关系。

2.2.2盐渍和糖渍荷叶中槲皮素变化趋势荷叶在未经过盐渍和糖渍处理前槲皮素的质量分数为4.90‰（槲皮素质量与荷叶干重比，测定数据误差为0.2‰）。由图3可知，在盐渍和糖渍的过程中荷叶中槲皮素含量呈下降趋势。糖渍比盐渍使槲皮素的含量下降快。荷叶中槲皮素含量在糖渍1～9d大量减少，盐渍1～15d大量减少。糖渍9d槲皮素含量为3.37‰。盐渍和糖渍荷叶中槲皮素的含量在15d分别降低至3.44‰和3.23‰。糖渍荷叶中槲皮素含量低于盐渍荷叶。在荷叶盐渍和糖渍过程中，由于自身和微生物酶系的作用，使具有苦味的槲皮素含量降低。微生物脱苦法是目前国内外脱苦方法之一，其具有保留并丰富食品风味的优点［16］。此法主要是利用微生物能合成与脱苦相关的酶从而实现脱苦，在此具体代谢过程仍有待研究。

图2　槲皮素标准品液相图Fig.2　The HPLC chromatograms of quercetin standard

图3　荷叶盐渍和糖渍过程中槲皮素含量变化Fig.3　Variation of quercetin content in pickled process by salt and sugar

2.3荷叶碱含量变化

2.3.1荷叶碱标准曲线由液相测荷叶碱标准品如图4，求得回归方程为y（荷叶碱）=5.0533x-0.038，检出限为3.00～15.00μg/mL。荷叶碱保留时间为11.705min。

图4 荷叶碱标样液相图Fig.4　The HPLC chromatograms of lotus leaf standard

2.3.2盐渍和糖渍荷叶中荷叶碱变化趋势一般荷叶中荷叶碱含量为8.00‰～10.00‰（荷叶碱质量与荷叶干重之比，数据误差在0.2‰），该实验样品中荷叶碱质量分数为11.00‰。将荷叶盐渍和糖渍的过程中，荷叶碱含量出现逐渐上升的趋势，荷叶碱的质量分数见图5。盐渍和糖渍荷叶分别在3～6d、6～9d荷叶碱含量下降。在盐渍和糖渍第15d时，荷叶碱含量达到最大，其中盐渍荷叶质量分数达到了16.23‰，比初始值增加了47.50%，并且之后随着盐渍和糖渍时间的增加，荷叶碱含量变化趋于平缓；糖渍荷叶中荷叶碱质量分数为18.40‰，比初始值增加了76.14%。通过盐渍和糖渍的方法，荷叶中荷叶碱的含量大幅度增加。荷叶中具有荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、莲碱、亚美罂粟碱等生物碱［13］。荷叶中各种生物碱相互反应生成荷叶碱，是茶叶碱在腌制过程中含量增加的原因之一［17，3］。因此通过盐渍和糖渍的方式不仅改善了荷叶的风味，增加其可食性，成为一种腌制食品，而且还增加其荷叶碱的含量，增加了其保健价值。

图5　荷叶盐渍和糖渍过程中荷叶碱含量变化Fig.5　Variation of nuciferine content in pickled process by salt and sugar

2.4感官评定

表2　盐渍和糖渍对荷叶苦涩味影响Table 2　The effective on bitter and astringent of pickled lotus leaves by salt and sugar

表2显示了荷叶盐渍和糖渍过程中苦涩味的变化。随着盐渍和糖渍时间的增加，荷叶的苦涩味均降低。盐渍荷叶15d苦涩味均明显降低，无明显苦涩味。糖渍荷叶3d无明显涩味，9d无明显苦味。同时盐渍荷叶15d综合评定要低于糖渍9d。

3　结论

3.1盐渍和糖渍荷叶中单宁含量随着腌制时间增加而减少，后不再改变。盐渍荷叶和糖渍荷叶单宁含量分别降低至2.00μg/mL和1.02μg/mL。

3.2盐渍和糖渍荷叶槲皮素的含量随腌制时间的增加呈下降至平稳趋势，盐渍荷叶和糖渍荷叶槲皮素质量分数由4.90‰分别降低至3.44‰和3.23‰。

3.3盐渍和糖渍荷叶中荷叶碱的含量随腌制时间的增加呈增加至平稳趋势，盐渍荷叶和糖渍荷叶荷叶碱质量分数由11.00‰分别增加至16.23‰和18.40‰。

3.4荷叶通过盐渍和糖渍的方法可以明显的降低苦涩味，且其有效成分荷叶碱有所增加。糖渍和盐渍达到无明显苦涩味分别在糖渍9d，盐渍15d。

［1］王玲玲，刘斌，石任兵.荷叶的化学成分研究［J］.天然产物研究与开发，2009（21）：416-419.

［2］古山春夫.pH对荷叶有效成分提取的影响及其分离分析［D］.无锡：江南大学，2009.

［3］Zheng ZJ，Wang ML.Preparative separation of alkaloids from Nelumbo nucifera leaves by conventional and pH-zone-refining counter-currentchromatography［J］.ChromatographyB，2010（878）：1647-1651.

［4］王普.荷叶、芦荟、茶叶中有效成分的分离［D］.长沙：湖南师范大学，2007.

［5］王福刚，曹娟，刘斌，等.荷叶的化学成分及其药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2010，21（9）：2339-2340.

［6］Soares S，Mateus N，Freitas VD.Carbohydrates inhibit salivary proteins precipitation by condensed tannins［J］.Agric Food Chem，2012，60：3966-3972.

［7］马志宏，陆忠兵，石碧.单宁酸化学性质及应用［J］.天然产物研究与开发，2003，15（1）：87-90.

［8］Luo XB，Chen B，Liu JJ，et al.Simultaneous analysis of N-nornuciferine，O-nornuciferine，nuciferine，and roemerine in leaves of Nelumbo nucifera Gaertn by high-performance liquid chromatography-photodiode array detection-electrospray mass spectrometry［J］.Analytica Chimica Acta，2005，538：129-133.

［9］孔文琦，李严巍.荷叶活性化学成分及药理研究进展［J］.中药研究与信息，2005，7（6）：22-44．

［10］王琦，殷建忠.荷叶固体饮料的研制［J］.现代食品科技，2011，27（5）：553-554.

［11］黄阿根，郑瑞昌，周兰香.荷叶饮料的工艺研究［J］.江苏农业研究，2002，21（4）：54-57.

［12］李娜.桑葚花色苷的分离纯化［D］.北京：北京化工大学，2010.

［13］Ma WY，Lu YB，Hu RL，et al.Application of ionic liquids based microwave-assisted extraction of three alkaloids N-nornuciferine，O-nornuciferine，and nuciferine from lotus leaf［J］. Talanta，2010，80：1292-1297.

［14］2000年版附录VA，中国药典［S］.

［15］刘树兴，赵芳.荷叶生物碱的含量测定方法及抑菌活性研究［J］.食品研究与开发，2009，29（3）：124-126.

［16］王志国.微生物与柑桔汁脱苦［J］.食品科技，2000，21（11）：10-14.

［17］雷红松，肖文军，魏勇.荷叶生物碱的研究进展［J］.吉首大学学报，2007，28（5）：92-94.

Study on content changes of the bitter and astringent in pickled process of lotus leaves by salt and sugar

LIU Ya-qi1，XU Mei1，LI Yang1，ZHOU Ming-quan2，WANG Jin-hua1，HU Zhong-li2，HE Jian-jun3，LI Dong-sheng1，WANG Chao1，*
（1.Hubei Collaborative Innovation Center of Industrial Fermentation，Research Center of Food Fermentation Engineering and Technology of Hubei，Hubei University of Technology，Wuhan 430068，China；2.Lotus Root Center of Wuhan University，Wuhan 430072，China；3.Institute of Processing of Agricultural Produce and Nuclear Agricultural Research，Hubei academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430068，China）

In this paper，the content of the main bitter and astringent substances of lotus leaves，which was quercetin and tannin of lotus leaves，were carried out dynamic detection during salt and sugar pickled process and the bitter and astringent taste of lotus leaves were evaluated by sensory experiment.The results showed that the content of quercetin and tannin both decreased during salt and sugar pickled process.The content of tannin which was in the salt and sugar pickled lotus leaves decreased by 72.56%and 71.15%，respectively. Then the content of quercetin decreased by 29.79%and 34.08%，respectively.At same time the nuciferine increased by 47.50%and 76.14%in salt and sugar pickled process，respectively.There was no significant bitter and astringent taste，when lotus leaves salt pickled time was15d and sugar pickled time was 9d，the lotus leaves could achieve a good edible.The optimum salt and sugar pickled time of lotus leaves was 15d and 9d respectively.

lotus leaf；salt；sager；nuciferine；quercetin；tannin

TS201.1

A

1002-0306（2015）10-0110-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.10.014

2014－07－30

刘雅颀（1989-），女，硕士研究生，研究方向：天然产物化学。

汪超（1978-），男，博士，教授，研究方向：天然产物化学。

国家科技支撑计划（2012BAD27B03）；国家科技支撑计划（2012BAD31B08）。