PEG10表达与原发性肝癌预后相关性分析

张海 胡亚华 朱艳莉 常城 李丹 余力群

·论 著·

PEG10表达与原发性肝癌预后相关性分析

张海 胡亚华 朱艳莉 常城 李丹 余力群

目的 检测PEG10在原发性肝癌（PHC）组织中表达的情况，探讨其与临床病理参数的关系及对肝癌预后的临床意义。方法 应用免疫组织化学方法（SP法）检测58例PHC患者肝组织中PEG10的表达情况，并分析PEG10与PHC临床病理特征及预后的关系。结果 58份PHC标本中44份PEG10阳性，其中“+”16份、“++”13份和“+++”15份。平均随访时间为40.5m，至随访结束时共有23例（39.7％）患者死亡；所有患者中位生存时间为31m，PEG10表达为“-”、“+”、“++”、“+++”的中位生存时间分别为57、34、27和15m，不同PEG10表达组间生存率差异有统计学意义（P=0.000）；PEG10在女性、晚期病例、术前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌患者肿瘤组织中表达更高（P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤直径、病因无关（P＞0.05）；早期复发病例中PEG10阳性比例明显高于阴性（P＜0.05），而晚期复发病例组间无明显差异（P＞0.05）。PEG10预测PHC复发的诊断特异度77.5％，敏感度为38.9％，准确率为65.5％，多因素COX模型中AJCC分期、微血管侵犯、病因和PEG10表达是影响PHC预后的危险因素（P＜0.05），其中PEG10阳性的HR达6.724。结论 PEG10对PHC预后具有很好的评估价值，但是其特异性高而敏感性不高，需要联合其他指标作出综合评价。

PEG10；原发性肝癌；复发

原发性肝癌（primary hepatic carcinoma，PHC）是一种高侵袭性恶性肿瘤，由于晚期诊断、肿瘤复发和化疗药物耐受等多种风险因素的共同作用，PHC总体预后相对较差，辨别预后不良的患者并进行及时的干预是提高PHC生存率最有效的方法之一［1］。印迹基因父系表达基因10（paternally expressed gene 10，PEG10）于2001年首次由 Ono发现后受到学界高度关注，研究表明，PEG10基因的高表达与肿瘤特别是肝癌发生关系密切［2］。本研究采用免疫组化技术检测PHC组织中PEG10的表达，并分析其与预后的相关性，为临床决策提供更多依据。

资料和方法

一、研究对象

选择2009年2月至2012年11月期间在黄石市中心医院肝胆外科择期行肝癌根治性切除术的患者，入选标准：①年龄≤70周岁，性别不限；②肿瘤组织完整切除（指术后1m影像学检查无病灶残留，同时手术切缘病理学阴性），术后病理组织学确诊为PHC，术前术后均未进行放、化疗及免疫治疗；③了解研究内容、愿意配合随访并签署知情同意书。收集患者性别、年龄、肿瘤直径、美国癌症联合委员会（AJCC）分期、分化程度、微血管侵犯、AFP和病因等资料。患者术后每3个月复诊1次，根据需要进行体格检查、影像学或活体组织检查，生存期从手术之日起开始计算，终止日期为死亡期或末次随访日期，截止时间为2014年12月31日。

二、主要试剂

鼠源性PEG10单克隆抗体，由上海基因科技有限公司生产，按1∶400的体积浓度进行稀释；SP免疫组织化学染色试剂盒、浓缩型DAB试剂盒均购自北京绿源大德生物科技有限公司。

三、标本制备

采用SP法进行免疫组织化学染色，石蜡包埋手术标本制成4μm厚切片，抗原修复采用高压热修复法，在沸水中加入0.01mol/L的柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），将玻片置于金属染色架上缓慢加压30min，盖上不锈钢锅盖但不锁定，10min后除去热源，置入凉水中。鼠源性PEG10单克隆抗体室温下孵化30min，免疫组化染色SP法检测各标本组织中PEG10的表达，操作步骤严格参照试剂盒说明书。以胎盘蜕膜组织切片作阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替抗体做阴性对照。

四、检测方法

PEG10阳性表达由两位高年资的病理科医师分别进行判断，PEG10抗原阳性反应表现为细胞质内的棕黄色颗粒，按染色强度及阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分比综合计分。每张切片随机采集10个具有代表性的视野以半定量的方法计算阳性表达率，根据胞质或胞膜有棕黄色颗粒染色强度分为无色（-）为0分，淡黄色（+）为1分，棕黄色（++）为2分，棕褐色（+++）为3分；阳性细胞数：小于总数的5％（-）计为0分，5％～25％（+）为1分，26％～50％（++）为2分，大于50％（+++）为3分。染色强度得分与阳性细胞数得分相乘，0分计为阴性（-），1～3分计为弱阳性（+），4～5分计为中度阳性（++），≥6分计为强阳性（+++）［3］。

五、统计学方法

以SPSS19.0统计学软件进行数据分析，其中PEG10蛋白表达与PHC临床病理学特征采用χ2检验，组间生存情况分析采用Kaplan-Meier分析，不同生存曲线的差异性检验用对数秩检验（Log-rank test）；运用多因素COX模型综合评价和权衡各因素对预后生存的影响，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、一般情况

共收集手术标本58份，PEG10阳性44份（75.9％），其中“+”16份、“++”13份和“+++”15份；随访时间为5～68m，中位随访时间为40.5m，至随访结束时共有23例（39.7％）患者死亡。

二、PHC组织中PEG10表达与生存时间的关系

所有患者中位生存时间为31m，PEG10“-”、“+”、“++”、“+++”患者中位生存时间分别为57、34、27和15m，不同PEG10表达组间生存率差异有统计学意义（χ2=40.114，P=0.000），PHC患者生存时间随PEG10表达强度增加而逐渐下降，见表1和图1。

表1 不同PEG10表达与生存时间的关系

三、PEG10与PHC患者临床病理参数的关系

PEG10在女性、晚期病例、术前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌患者肿瘤组织中表达更高（P＜0.05），而与患者年龄、肿瘤直径、病因相关性较小（P＞0.05）；早期复发病例（≤2y）中PEG10阳性比例明显高于阴性（P＜0.05），而晚期复发病例组间无明显差异（P＞0.05），见表2。

图1 不同PEG10表达与PHC总生存率的关系

表2 PEG10表达与PHC患者临床病理参数的关系

四、PEG阳性对PHC复发的预测价值

以 PEG10阳性（包括+、++和+++）预测PHC复发，诊断特异度77.5％，敏感度为38.9％，阳性预测值43.75％，阴性预测值为73.8％，准确率为65.5％（Kappa值为0.217，P=0.824）。

五、COX比例风险模型分析

对可能影响原发性肝癌预后的9个相关因素：患者年龄、性别、肿瘤直径、AJCC分期、分化程度、微血管侵犯、AFP、病因和PEG10的表达引入多因素COX模型，结果显示，AJCC 分期、微血管侵犯、病因和PEG10的表达是影响PHC预后的因素（P＜0.05），其中PEG10表达HR达6.724，见表3。

表3 PHC临床病理特征与生存时间的多因素COX 回归分析

讨论

随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的血清肿瘤标志物被发现，对恶性肿瘤的早期诊断、疾病发展以及预后监测提供了帮助。PEG10基因定位于人类染色体7q21，主要编码一种与反转录病毒gagpol蛋白具有高度同源性的蛋白质［4］。PEG10基因具有更高的肝癌组织特异性，在相应的癌旁组织、正常肝组织中以及其他非肝脏来源的肿瘤细胞中均不表达。基础研究表明，PEG10基因可能存在特异性调控肝脏细胞生长的作用，上调PEG10的表达能促进癌前组织向癌组织发展，而沉默PEG10表达可以抑制肝癌细胞的生长［5］。因此，通过抑制PEG10的表达，有可能成为抑制PHC发生和发展的治疗手段，使PEG10具有作为肝癌诊断标志物和基因治疗新靶点的双重潜力［6］。

国内外有多项研究表明［7-11］，PEG10表达与PHC性别、年龄、分化程度、疾病分期等因素相关。Bang等［12］纳入了218例PHC术后患者进行随访，发现PEG阳性是生存时间的独立危险因素（HR=2.041）。本组病例中PEG阳性表达与女性、晚期病例、术前AFP＞200ng/mL、微血管侵犯、低分化肝癌相关，而且PEG10是PHC术后早期复发的独立预测因素，PEG10的表达强度与中位生存期呈明显的负相关，PEG10表达用于早期复发和生存时间的预测具有可行性。血清AFP是临床最常用的PHC诊断和检测工具，也是判断预后和检测复发的重要指标，Cucchetti等［13］认为AFP＞60ng/mL是肝癌根治术后复发的高危因素，但由于AFP在肝炎、肝硬化等疾病中也有升高，且有一定的假阳性率，而且PHC患者中只有60％～70％的患者会出现AFP升高，对于肿瘤体积较小的患者阳性率更低至33％～65％。同时AFP的预测效能与浓度相关，当术后AFP≤20ng/mL时，目前尚无有效的生物学指标进行疗效检测，Bang［12］的研究表明，在AFP≤20ng/mL时，PEG10依然与复发率明显相关。因此对于AFP阴性的患者，PEG10将可成为有效的检测指标。

值得注意的是，本研究中PEG阴性的患者仍有3例出现早期复发，8例晚期复发，PEG10诊断效能总体偏低（特异度77.5％、敏感度38.9％、准确性65.5％），原因除了与本研究样本量偏少外，影响PHC预后的因素很多，单独某一个因素的预测价值通常不高。吴凤霞［14］对AFP、CK19、PEG10、IQGAP1进行联合检测分析发现，单项检测血清肿瘤标志物可能会出现漏诊，联合两个或多个标志物检测可能会弥补这个缺点。

综上所述，PEG10在肿瘤的发生、发展中起调控作用，其表达强度可以反映肿瘤的分化程度及肿瘤的侵袭性，对PHC预后具有很高的评估价值，但是其特异性高而敏感性不高，所以不能独立使用，需要联合其他指标作出综合评价。

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hepatocellular carcinoma：Surveillance，diagnosis and prediction of prognosis.World J Hepatol，2015，7：139-149.

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3 陈锟，解新，孙和国，等.父系表达基因10蛋白在肝细胞癌组织中的表达及临床意义.检验医学与临床，2011，8：2951-2953.

4 刘瑶，廖跃光，黄才斌，等.肝细胞癌组织中PEG10、SIAH2的表达及其意义.临床与实验病理学杂志，2012，28：371-377.

5 林昀，张云丽，胡昕，等.PEG10基因在肝癌组织中高表达的分子机制及其功能的研究.肿瘤，2013，33：28-35.

6 高燕，张厚德，林菊生，等.人肝癌父系表达基因10的遗传印记状态.中华肝脏病杂志，2010，18：894-899.

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11 Rich N，Singal AG.Hepatocellular carcinoma tumour markers：current role and expectations.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2014，28：843-853.

12 Bang H，Ha SY，Hwang SH，et al.Expression of PEG10 Is Associated with Poor Survival and Tumor Recurrence in Hepatocellular Carcinoma.Cancer Res Treat，2015，Feb 13 （Epub ohead of print）.

13 Cucchetti A1，Piscaglia F，Caturelli E，et al.Comparison of recurrence of hepatocellular carcinoma after resection in patients with cirrhosis to its occurrence in a surveilled cirrhotic population.Ann Surg Oncol，2009，16：413-422.

14 吴凤霞.血清肿瘤标志物AFP、CK19、PEG10和IQGAP1在肝癌中表达的研究.河南大学，2014.

The correlation analysis between expression of PEG10 and prognosis of primary hepatic carcinoma

ZHANG Hai，HU Ya-hua，ZHU Yan-li，CHANGCheng，LI Dan，YU Li-qun.Ceatral Hospital of Huangshi，Huangshi 435000，China

Objective To detect the expression of PEG10 in primary hepatic carcinoma（PHC）tissues，to explore its relationship between clinical pathological parameters and prognosis of PHC.Methods The expression of PEG10 was detected by immunohistochemical（SP method）in 58 carcinoma tissues of PHC patients in our hospital.The relationship between PEG10 and clinical pathological characteristics or prognosis of PHC was analyzed.Results Among 58 specimens，44 were tested positive for PEG10，including 16 of＂+＂，13 of＂++＂and 15 of＂+++＂.The average follow-up was 40.5 months，and 23 cases（39.7％）dead by the end of follow-up.The median survival time was 31 months for all cases.And 57 months，34months，27months，15months for PEG10＂-＂，＂+＂，＂+ +＂，＂+ + +＂groups，respectively.The survival rate in different groups had significant differences（P=0.000）.Levels of PEG10 in the female，advanced tumor，preoperative alpha fetal protein（AFP）＞200ng/mL，microvascular invasion and poorly differentiated tumors cases were higher（P＜0.05），while had no relation with age，tumor diameter or etiology（P＞0.05）.Among early recurrent cases，ratio of PEG10-positive was higher than that of PEG10-negative（P＜0.05），however，which showed no significant difference in late recurrent groups（P＞0.05）.The specificity，sensitivity and accuracy rate of PEG10 in prediction of PHC recurrence was 77.5％，38.9％ and 65.5％，respectively.AJCC stage，microvascular invasion，etiology and PEG10 expression were risk factors for PHC recurrence by multivariate COX analysis（P＜0.05），in which PEG10 positive HR was 6.724.Conclusion PEG10 can effectively predict the prognosis of PHC with a high specificity but low sensitivity，which should be conjunct with other indicators to make a comprehensive evaluation.

PEG10；Primary hepatic carcinoma；Recurrence

2015-03-24）

（本文编辑：赖荣陶）

2013-2014年度湖北省卫生厅科研指导性项目（JX6C-48）

435000 湖北黄石 湖北理工学院附属黄石中心医院消化内科（张海，胡亚华，朱艳莉，常城，余力群），科教科（李丹）通信作者：胡亚华，Email：33575296@qq.com