不同形态亚型的结节型肝细胞癌病理组织中VEGF、微血管密度表达及其临床意义

罗威明 单文姣 张子敬 郝一

·论 著·

不同形态亚型的结节型肝细胞癌病理组织中VEGF、微血管密度表达及其临床意义

罗威明 单文姣 张子敬 郝一

目的 探讨不同形态亚型的结节型肝细胞癌病理组织中VEGF、微血管密度表达及患者预后生存情况。方法 收集2008年3月至2010年11月行手术切除的癌症组织标本103份，研究对象根据肝癌大体形态分为3组：单个结节型肝细胞癌组（SN组），多结节融合型细胞癌组（CM组）和单个结节外生长细胞癌组。SP免疫组化法分析癌症组织VEGF阳性表达情况；免疫组化分析微血管密度（MVD）；Western印迹检测组织中p-Akt表达情况；采用Kaplan-Meier生存分析3种亚型患者近4年的生存情况。结果 CM组、SNEG组患者VEGF阳性表达率（CM组为78.95％，SNEG组为92.00％）以及MVD表达（CM为11.77±1.37，SNEG组为19.83±2.06）高于SN组（VEGF阳性表达率为67.80％，MVD表达量为6.75±1.21），其中SNEG组同SN组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；Western印迹检测结果显示SNEG组p-Akt相对表达量（0.891±0.059），CM组为（0.681±0.057）均高于SN组（0.421±0.039），差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），SNEG组高于CM组，具有统计学差异（P＜0.05）；Kaplan Meier法进行生存分析NHC中SN组患者平均生存时间为（3.4±0.3）年，明显高于CM组（2.1±0.5）年和SNEG组（0.9±0.3）年（P＜0.05），SN组预后优于CM组、SNEG组（P＜0.05）。结论 单个结节外生长细胞癌患者组织中VEGF、MVD以及p-Akt表达量高于单个结节型肝细胞癌或多结节融合型细胞癌患者组织，可能新生血管的形成与不同亚型结节型肝细胞癌患者生存率有一定的关系。

结节型肝细胞癌；血管内皮生长因子；微血管密度；p-Akt；生存分析

肝细胞癌是全球病死率位居第三位的恶性肿瘤之一，术后患者出现复发是导致患者预后不良的主要原因［1］。临床研究显示，肝细胞癌的复发以及癌细胞转移与肿瘤组织大小有一定的关联性。其中结节型肝细胞癌（NHC）预后较好［2］，但是，不同形态亚型NHC患者生存期不尽相同。肝细胞癌是典型的多血管癌，其发生、发展、复发及转移与新生血管形成有关［3］。本文旨在探讨不同形态亚型NHC的发生、发展及预后与血管新生的关系，报道如下。

资料和方法

一、一般临床资料

收集2008年3月至2010年11月在长沙医学院肿瘤科、肝胆外科进行手术切除的癌症组织标本103份，所有标本经病理证实均为NHC。患者中男性87例，女性16例，年龄37～75岁，平均（58.2±6.9）岁。肝癌组织直径2.4～5cm，平均为（3.65±0.93）cm，伴有门脉侵袭患者36例。所有研究对象根据肝癌大体形态分为3组：单个结节型肝细胞癌组（SN组）59例，多结节融合型细胞癌组（CM组）19例，单个结节外生长细胞癌组（SNEG组）25例。所有患者在手术切除癌组织前均为接受放疗、化疗以及抗癌药物等相关治疗，同时告知患者本研究的获益及风险、签订知情同意书，报医院伦理委员会审批同意。术后随访3～4年，平均随访时间（24.6±6.9）个月。

二、检测指标及方法

（一）免疫组化学染色法检测组织中VEGF表达选用兔抗人VEGF多克隆抗体，采用SP法检测组织中VEGF表达（二步法试剂盒以及DAB显色系统均购自美国Santa Cruze公司）。实验步骤为：组织经脱水、蜡封呈块状后切成4μm的薄片，放入到60℃烘箱中过夜，经二甲苯脱蜡后、梯度乙醇进行脱水，3％过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，血清进行封闭；4℃冰箱一抗（1∶50工作浓度）孵育过夜，PBS清洗，二抗孵育4h后加入辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB染色，封片后镜检。阴性对照组以PBS作为一抗。每张切片选取5个200倍视野，采用高倍电子显微镜进行拍摄，以及Image-Pro Plus6.0软件计算每张切片视野中阳性表达部分的平均吸光度值（OA）以及累积吸光度值（IA）。

（二）Western印迹检测p-Akt的表达肝癌组织经活检取出，通入液氮研磨使细胞充分破裂，将破碎的组织装入玻璃混匀器中，按照100μL/10ng加入适量裂解液（含PMSF），冰上孵育30 min，然后4℃，以12 000r/min离心5 min，上清液-80℃保存备用。组织总蛋白经考马斯亮蓝进行定量。组织蛋白质样品加入1/4倍量5×SDS上样缓冲液进行混匀，煮沸变性6min左右，10％SDS-PAGE115 进行电泳，210mA恒流1h 40min湿转至硝酸纤维膜（NC膜）上。5％脱脂奶粉TBST缓冲液室温封闭3h，加抗p-Akt单抗（鼠抗人，1∶500）。TBST洗膜3次，每次10min，然后与结合辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）室温孵育1h，TBS洗膜3次，每次10min，最后采用发光试剂盒ECL反应，X胶片曝光显影。

（三）计数肝癌患者微血管密度（MVD）采用免疫组化法检测各组肝癌组织微血管密度。10％甲醛固定后，乙醇脱水，石蜡包埋等，鼠抗Ⅷ因子相关抗原单克隆抗体为第一抗体进行免疫组化检测，根据Weidner报道的计数方法进行，每个切片随机选取5个视野现在低倍镜放大视野（20×20倍），再在200倍视野下计数染成棕色血管的数目，累计后取平均值作为每个视野的血管密度。统计不同组别患者VEGF阳性表达例数。

三、统计学分析方法

采用SPSS 17.0统计学软件包处理数据，数据以均数士标准差（-x±s）表示，数据之间采用配对t检验，而对于计数资料采用卡方检验，采用Kaplan Meier法进行生存分析，差异显著性检验采用Long-rank test进行，所有数据均以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

一、不同组别患者组织中VEGF表达比较

研究结果显示，CM组、SNEG组患者VEGF表达阳性患者例数高于SN组，其中SNEG组同SN组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1、图1。

二、不同组别组织中MVD表达情况

研究显示，不同亚型肝组织中MVD表达量不尽相同。MVD表达量CM组为（11.77±1.37）、SNEG组为（19.83±2.06）高于SN组（6.75±1.21），差异具有统计学意义（t=6.43、12.19，P=0.029、0.001）；而SNEG组高于CM组，差异有统计学意义（t=8.27，P ＜0.05），见图2。

图1 SP免疫组化检测各形态肝癌组织中 VEGF表达（×400）

图2 免疫组化检测各形态肝癌组织中 MVD表达（×200）

表1 不同组别肝癌组织 VEGF表达结果比较

三、Western印迹检测组织中p-Akt表达

Western印迹检测结果显示，患者组织中p-Akt表达量SNEG组为0.891±0.059、CM组为0.681±0.057明显高于SN组0.421±0.039，差异有统计学意义（t=15.21，P＜0.05或t=10.76，P＜0.01），SNEG组高于CM组，差异有统计学意义（t=9.15，P ＜0.05），见图3。

图3 Western印迹检测各形态肝癌组织中 VEGF表达（×200）

四、不同亚型NHC患者预后情况分析

采用Kaplan Meier法进行生存分析，绘制生存曲线，Long-rank检验3组患者生存曲线。结果显示，NHC中SN组患者平均生存时间为（3.4±0.3）年，明显高于CM组（2.1±0.5）年和SNEG组（0.9±0.3）年（P＜0.05）。SN组、CM组以及SNEG组4年内生存率分别为72.8％，50.3％以及29.7％。通过生存曲线显示，SN组预后优于CM组、SNEG组（P＜0.05），而生存率方面3组差异无统计学意义，见图4。

图4 3组患者生存曲线

讨论

目前采用诸如血管介入疗法、射频消融治疗、放疗等以及采用一些新药如索拉菲尼等治疗肝细胞癌虽然取得了一定进展［4］，但其生存率仍旧不理想，手术切除和肝移植是目前较为公认的治疗肝细胞癌的有效方式［5］。由于结节型肝细胞癌采用手术治疗后其预后较好，因此临床研究不同治疗方法对于结节型肝细胞癌与生存期的关系成为热点。有报道指出，单个结节伴有外生长型患者出现门静脉癌栓、肝内转移及预后不良反应高于其他亚型［6］。

血液供应是实体肿瘤生长、发展以及癌细胞转移的必要条件。有研究显示，肿瘤患者瘤组织中MVD可以作为衡量肿瘤出现浸润、复发以及转移等生物特异性有关，肝癌患者中高MVD相对于低MVD患者出现复发、转移的概率明显增高，这说明在肝癌患者组织中高MVD表达将进一步导致残癌组织以及剩余癌细胞生长、发展等［7-8］。本研究显示，不同亚型患者肝癌组织中MVD表达明显不同，其中SNEG组患者中MVD表达量明显高于SN组、CM组。单个结节外生长型患者出现高MVD可能与其预后差有一定的关联性。VEGF是近些来年来用于研究肿瘤血管生成的热门因子之一。肝癌是典型的多血管肿瘤，有报道曾指出肝癌患者中85.7％VEGF表达呈阳性［9］，而这些阳性表达患者中有50％的患者出现淋巴转移，而VEGF阴性患者出现淋巴转移的比率明显低于阳性表达患者，正常肝脏中VEGF表达为阴性，而肝癌组织中其阳性标率达到63.3％，肿瘤细胞可以分泌血管内皮生长因子，从而促进新生血管的生成，进一步导致癌细胞出现转移［10］。此外，VEGF的高表达也是组织中形成新生血管以及维持血管渗透性的标志物，其与组织中微血管形成、密度有直接关系［11］。本研究显示，不同亚型结节型肝细胞癌患者VEGF表达情况不尽相同，其中SN组出现阳性表达患者比率高于CM组、SNEG组，说明当结节型肝癌出现外生长时，其血管新生也出现高度表达。

肝细胞癌的发生发展与多种细胞信号途径有关。其中PI3K/Akt信号通路与肝癌的发生发展密切相关。PI3K/Akt信号通路广泛存在于机体内各细胞内，其在恶性肿瘤细胞增殖、新生血管形成以及侵袭转移等方面起着重要的作用［12］。研究显示，肿瘤微环境下产生的多种细胞因子均可以刺激该通路磷酸化，如血小板源生长因子、血管内皮生长因子等［13］。以往的研究也证实肝细胞癌与Akt磷酸化有一定的关联系，但鲜为报道结节型肝细胞癌不同亚型血管新生情况，以及引起血管异常新生的分子机制［14］。通过本研究显示，SNEG组、CM组患者组织中p-Akt表达量明显高于SN组。Akt磷酸化将进一步刺激下游细胞因子以及细胞器反应，从而促进血管新生。本研究发现，不同亚型结节型肝细胞癌患者中血管新生现象并不一致，其中出现外生型患者血管新生现象更为明显，也有报道显示单个结节外生型肝癌患者生存期低于单个结节型肝细胞癌或多结节融合型细胞癌［15］，这也说明结节型肝细胞癌患者出现明显的血管新生与其预后生存有一定的关联性。

总之，单个结节外生长细胞癌患者组织中VEGF、MVD以及p-Akt表达量高于单个结节型肝细胞癌或多结节融合型细胞癌患者组织，可能新生血管的形成与不同亚型结节型肝细胞癌患者生存率有一定的关系。

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VEGF and MVD in pathological tissues of different forms of nodular HCCsubtypes and their clinical significance

LUO Wei-ming，SHAN Wen-jiao，ZHANG Zi-jing，HAO Yi.Department of Pathology，Institute of Basic Medical Sciences，Changsha Medical University，Changsha 410219，China

Objective To investigate vascular endothelial growth factor（VEGF）and microvessel density（MVD）in pathological tissues of different forms of nodular hepatocelluar carcinoma（NHC）subtypes，and to study their relationship with prognosis of the NHC patients.Methods A total of 103 patients，with NHC，which underwent surgical resection at the department of oncology and hepatobiliary surgery in our hospital from March 2008 to November 2010，were enrolled.According to the general form of liver cancer，study subjects were divided into three groups，including single nodular HCC group（SN group），multinodular converged cell carcinoma group（CM group）and single extranodule growth cell carcinoma group（SNEG group）.Detections of VEGF and MVD in cancer tissue were carried out by SP immunohistochemical and immunohistochemical methods，respectively.Western blot was conducted to measure the expression of p-Akt in tissues.Survival for nearly four years of patients in three subtypes was analyzed by Kaplan-Meier survival analysis，respectively.Results Compared to SN group，there were more VEGF positive patients with higher levels of MVD expression in CM and SNEG group，and there was a statistically significant difference（P＜0.05）among SNEG and SN groups.Western blot showed that p-Akt expression fromLiver tissues in SNEG and CM groups was significantly higher than that in SN group（P ＜0.05 or P＜0.01），and p-Akt expression in SNEG group was significantly higher than that in CM group（P＜0.05）.Kaplan Meier survival analysis of NHC patients showed that average survival time for patients in SN group was 3.4±0.3 years，which was significantly higher than those in CM（2.1±0.5 years）and SNEG（0.9±0.3 years）（P＜0.05）groups.In addition，the prognosis in SN group was better than those in CM and SNEG groups（P＜0.05）.Conclusion Levels of VEGF，MVD and p-Akt expression in SNEG group were higher than those in SN and CM groups，which showed that there might be a certain relationship between the newborn blood vessel formation and the survival rate of patients with NHC in different subtypes.

Nodular hepatocellular carcinoma；Vascular endothelial growth factor；Microvessel density；P-Akt；Survival analysis

2015-04-27）

（本文编辑：赖荣陶）

2014年湖南省教育厅科学研究一般项目（14C0116）；2014年湖南省普通高等学校教学改革研究项目（554）作者单位：410219 长沙医学院基础医学系病理教研室

郝一，Email：haoyi5000@163.com