影响骨髓间充质干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化患者近期预后因素分析

郑联坵 潘兴南

·论 著·

影响骨髓间充质干细胞移植治疗乙型肝炎肝硬化患者近期预后因素分析

郑联坵 潘兴南

目的 了解影响骨髓间充质干细胞（BM-MSC）移植治疗乙型肝炎肝硬化（HBV-LC）患者的预后因素。方法HBV-LC患者158例，根据终末期肝病模型（MELD）评分、年龄、性别进行1∶1配对，将患者分为治疗组79例，对照组79例。治疗组在抗病毒、保肝等基础治疗上行BM-MSC移植术，对照组仅给予抗病毒、保肝等治疗。记录治疗组术前并发症、生化、凝血功能等指标，随访3年。结果 治疗组的患者中存活与死亡亚组上消化道出血和肝肾综合征发生率差异有统计学意义（χ2分别为9.278和8.365，均P＜0.05），但自发性腹膜炎无明显差异（χ2=0.633，P＞0.05）。治疗组的Child-Pugh评分（CPS）B级和C级的3年生存率与对照组相比差异均有统计学意义，进一步分析发现CPS为B级的患者生存率优于C级。治疗组术后死亡与否的单因素分析发现TBil、MELD评分、国际标准化比值（INR）、肌酐（Cr）差异显著，作多因素Logistic回归和ROC曲线分析发现，血清白蛋白低于23.4 g/L、MLED评分高于18.37分、TBil高于96.4μmol/L和INR高于1.97为治疗组患者死亡的高危因素。结论 BM-MSC移植能够提高HBV-LC患者3年生存率，术前合并上消化道出血和肝肾综合征及低Alb和高TBil、MELD评分、INR为BM-MSC移植术后死亡的高危因素。

骨髓间充质干细胞；乙型肝炎肝硬化；预后；生存期

乙型肝炎肝硬化（HBV-LC）主要表现为肝功能损伤和门脉高压［1］。许多HBV-LC患者因一个或多个并发症而死亡［2］，如上消化道出血、肝性脑病、肝肾综合征、自发性腹膜炎等。由于移植的肝源短缺、费用昂贵和潜在的严重并发症使得肝移植的推广受到严重的限制［3-5］。

自从1999年Petersen等［6，7］研究报道肝细胞有骨髓源性后，骨髓间充质干细胞（BM-MSC）可向肝细胞分化的研究成为生命科学研究的热点。国内外学者的研究结果显示，BM-MSC对肝硬化治疗的疗效不尽相同。一些学者报道BM-MSC移植在动物模型中证实其能够改善肝脏纤维化，逆转急性肝衰竭［8-11］。临床研究也证实了BM-MSC移植能够迅速改善肝功能，BM-MSC治疗失代偿性肝硬化能够减少腹水及改善乏力等症状，提高患者生存率，且BM-MSC可通过减轻肝脏纤维化从而减少进展为肝癌的风险［12-17］。但也有研究发现，应用BM-MSC移植治疗肝硬化未能提高患者肝功能和生存率，甚至可增加肝纤维化甚至肝癌的风险［18，19］。分析以上研究发现，因选择的病种、病情及治疗时机等不尽相同，这些可能是影响BM-MSC移植术后疗效不同的混杂因素。本研究探讨BM-MSC移植治疗HBV-LC患者死亡的高危影响因素，为临床上BM-MSC移植治疗HBV-LC患者提供参考。

资料和方法

一、病例选择

2007年至2010年在解放军第一八○医院肝病中心住院的HBV-LC患者158例，所有患者诊断均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2010年）》标准，同时排除肝功能衰竭、其他原因导致肝硬化及影像学证实发展至肝癌阶段的患者。按照终末期肝病模型（MELD）评分、年龄、性别等进行1∶1配对，将158例患者分为治疗组和对照组，每组79例。治疗组给予抗病毒、保肝等基础治疗的基础上行BM-MSC移植术，对照组仅给予抗病毒、保肝等基础治疗。本项目已通过医院器官移植伦理委员会审查批准，并在上级卫生部门备案。所有治疗患者在知情同意的情况下，均已签定知情同意书。

二、BMSC的采集

在层流无菌治疗室内，选患者双侧髂后上棘为骨髓采集点，常规消毒铺巾局部浸润麻醉后，用18号骨髓穿刺针穿刺，骨髓量为（84.5±11.3）mL，用4000 U肝素抗凝，采集过程中避免污染。

三、BM-MSC的分离及确认

将患者骨髓离心，然后去除脂肪层，用等量DMEM培养液稀释穿刺抽取的骨髓液，制成细胞悬液［18］。将骨髓轻轻加到密度1.073 g/mL的percoll分离液上，1200×g，25 min（室温下）。吸取界面细胞层，用0.9％氯化钠溶液洗脱，1500×g，5 min离心共3次。用0.9％氯化钠溶液重悬细胞，并留取少量细胞培养5 d和8 d，通过显微镜下观察细胞形态（图1）生长良好，并计数所得BM-MSC大于1.0×107/mL，将其放置37℃的二氧化碳孵箱待用。

四、BM-MSC的移植

在介入治疗室DSA下，采用Seldinger技术行股动脉穿刺肝动脉插管术，将分离待用的BM-MSC，在DSA造影确认未见肝内肿瘤后，经肝动脉导管缓慢注入肝内，最后用20 mL 0.9％氯化钠溶液冲洗管腔。

五、随访

记录患者BM-MSC移植前并发症情况、生化、凝血功能、Child-Pugh评分（CPS）及MELD评分等，随访3年。

图1 骨髓间充质干细胞的形态

六、统计学方法

所有资料均采用SPSS 16.0软件进行统计分析，Prism 5.0软件进行作图。按CPS不同等级采用Kaplan-Meier法进行生存分析，通过对移植前计数资料进行单因素分析并做显著性检验（P＜0.05），然后对差异有统计学意义的因素进行多因素Logistic回归，最后绘出ROC曲线，按AUC＞70％为有意义［20］，计算出各指标的临界值。

结果

一、临床资料基本情况

纳入的患者均为HBV-LC，其中治疗组年龄为（47.4±12.3）岁，男女性别比例为8.4∶1，对照组年龄（46.9±13.1）岁，性别比例与治疗组相同。BMMSC移植前患者并发症分布情况为自发性腹膜炎16例次（20.3％），上消化道出血（UGH）14例次（17.7％），肝肾综合征（HRS）3例次（15.8％）。

二、HBV-LC患者并发症对BM-MSC移植术后的影响

治疗组79例患者随访3年，失访3例，存活47例，死亡29例。对存活和死亡患者的术前并发症进行分析（见图2），结果移植前患者的UGH及HRS发生率两组差异有统计学意义（χ2分别为9.278和8.365，均P＜0.05），说明UGH和HRS可能为HBVLC患者BM-MSC移植术后死亡的高危因素，而SBP两组差异无统计学意义（χ2=0.633，P＞0.05）。

图2 肝硬化患者并发症对BM-MSC移植术后预后的影响

三、BM-MSC移植治疗HBV-LC患者的生存分析

治疗组与对照组均随访3年，治疗组失访3例，对照组失访5例，两组失访率分别为3.8％和6.3％（均小于20％），提示结果较为可靠。将治疗组与对照组患者分为CPS评分B级和CPS评分C级两亚组，通过生存分析可知（见图3），CPS评分为B级和C级与对照组的3年生存率相比均差异有统计学意义（χ2= 4.036，P=0.049；χ2=4.434，P=0.039），进一步分析治疗组中的CPS评分为B级的3年生存率与C级相比差异有统计学意义（P=0.027）。说明治疗组能够提高患者的3年生存率，并且CPS评分为B的生存率优于C级的患者。

图3 治疗组与对照组不同CPS评分等级的3年生存曲线

四、影响BM-MSC移植治疗HBV-LC患者预后的因素

将治疗组移植前的各项指标按存活和死亡进行单因素分析并做显著性检验（见表1），通过单因素分析得到影响BM-MSC移植术后3年内死亡与否的主要相关因素有Alb、TBil、MELD评分、CR及INR，将以上指标作Logistic回归分析，发现低Alb、高TBil、CR、MELD、INR均为移植后患者死亡的高危因素。将以上指标进行ROC分析，取AUC＞0.70为有意义指标，并计算出各危险因素的临界值（见表2），提示患者术前Alb低于23.4 g/L、MLED评分高于18.37分、总胆红素高于96.4μmol/L和INR高于1.97为BM-MSC移植术后患者死亡的高危因素。

表1 生存组与死亡组的影响因素单因素分析

表2 BM-MSC移植治疗HBV-LC患者死亡高危因素的临界值

讨论

骨髓中富含间充质干细胞，BM-MSC是一类具有多向分化潜能的均质性细胞，目前许多研究表明它可诱导分化为成熟的肝细胞或胆管细胞，而且肝细胞生长因子（HGF）等细胞因子［21］或微环境［22］对干细胞的定向分化起重要作用。基于此，国内外学者做了大量的基础实验与临床研究，但得出的结论也不尽相同。国内学者Li等［8］的动物试验研究采用急性肝衰竭的猪模型发现，BM-MSC移植能够提高急性肝衰竭的远期生存率。Peng等［13］的BM-MSC治疗肝硬化患者的临床研究提出BM-MSC移植能够短期提高患者的肝功能，但36个月后两者差异无统计学意义，随访192周两组肝癌的发生率和生存率无明显差异，而Amer等［12］的研究报道了BM-MSC移植能够改善肝硬化患者的乏力症状，减轻腹水量，提高患者的生存率。近期Pan等［23］的一项meta分析共纳入了5篇文章，分别来自于中国、伊朗、巴西、埃及等国家的研究发现BM-MSC能够在1年内改善患者的肝功能及减轻乏力等症状，并提出影响BM-MSC治疗肝硬化患者近期预后的影响因素可能为移植前患者的病情、MELD评分及治疗前患者生化、凝血功能等。

本研究发现，BM-MSC移植前的并发症对预后有影响，术前并发UGH和HRS的患者为移植术后死亡的高危因素，这可能由于肝硬化后肝脏的血液供应差，肝血窦狭窄、毛细血管化严重导致门脉压力高，导致UGH，而BM-MSC移植只是改善肝脏实质细胞，无法改变患者门脉高压状态［23］。而并发症HRS可能由于随着肝硬化程度的加重，门静脉血流阻力增加，血管舒张因子合成增多，同时由于肝内分流和侧支循环，血管舒张因子由内脏血流释放至体循环，使体循环血管阻力进一步下降，引起体循环功能异常。在动脉循环极度充盈不足的情况下，机体通过激活交感神经系统、肾素-血管紧张素系统和抗利尿激素系统维持动脉血压，虽然此作用有助于维持有效血容量和血压，但严重影响肾功能，导致腹水、水肿以及高容量低钠血症，使肾血流量减少，肾小球滤过率下降，诱发各种肾内缩血管物质增加，进一步恶化肾功能所致［24］。国外一项多中心临床研究对263例肝硬化伴腹水患者随访41个月，结果显示HRS发生率为7.6％，患者生存期为2周至6个月［25］，而本研究中合并HRS患者生存期为12～14个月，提示BM-MSC可能可以提高HBV-LC合并HRS的患者生存期，但远期预后差。而SBP对BM-MSC移植预后的影响不明显，这可能与近年来对SBP治疗及时和通过腹水培养使用敏感的抗生素治疗相关。将治疗组与对照组按CPS分为B级和C级亚组，通过3年的生存分析可见，治疗组可以提高患者的生存率，对于CPS评分为C级患者提高生存率的差异显著，而CPS为B级提示治疗组也能提高患者的生存率（χ2=4.036，P=0.049），但分析数据发现CPS为B级亚组的患者例数较少，且P值接近于0.05，故在一定程度影响了结果的可靠信。进一步研究发现治疗组的CPS评分为B级的3年生存率优于C级。但对治疗组作单因素分析结果提示，移植后死亡与CPS评分无明显差异，分析治疗前患者CPS数据可知，纳入治疗组的患者CPS评分为8分至13分，且大部分CPS分值集中于10分左右，考虑与此有关。

将影响BM-MSC移植术后患者死亡因素进行单因素分析发现，TBil、Cr、INR、MELD评分这4个评价指标的P＜0.05，而血清Alb的P值接近于0.05将以上几个指标作多因素Logistic回归发现，低Alb和高TBil、Cr、MELD、INR均为移植术后患者死亡的高危因素。为明确临界值，我们采用ROC曲线对以上数据进行分析，取AUC＞0.70为有意义［20］得出临界值，提示HBV-LC患者血Alb低于23.4g/L、MLED评分高于18.37分、TBil高于96.4μmol/L和INR高于1.97，行BM-MSC移植治疗预后死亡风险高。

1 Lee WM.Hepatitis B virus infection.N Engl J Med，1997，337：1733-1745.

2 Bataller R，Brenner DA.Liver fibrosis.J Clin Invest，2005，115：209-218.

3 Lee DS，Gil WH，Lee HH，et al.Factors affecting graft survival after living donor liver transplantation.Transplant Proc，2004，36：2255-2256.

4 Dai LJ，Li HY，Guan LX，et al.The therapeutic potential of bonemarrow-derived mesenchymal stem cells on hepatic cirrhosis.Stem Cell Res，2009，2：16-25.

5 Terai S，Takami T，Yamamoto N，et al.Status and prospects of liver cirrhosis treatment by using bone marrow-derived cells and mesenchymal cells.Tissue Eng Part B Rev，2014，20：206-210.

6 Peterson BE，Bowen WC，Patrene KD，et al.Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells.Science，1999，284：1168-1170.

7 Theise ND，Badve S，Saxena R，et al.Derivation of hepatocytes from bone marrow cells in mice after radiation induced myeloablation.Hepatology，2000，31：2332-2340.

8 Li J，Zhang L，Xin J，et al.Immediate intraportal transplantation of human bone marrow mesenchymal stem cells prevents death from fulminant hepatic failure in pigs.Hepatology，2012，56：1044-1052.

9 Zheng L，Chu J，Shi Y，et al.Bone marrow-derived stem cells ameliorate hepatic fibrosis by down-regulating interleukin-17.Cell Biosci，2013，3：46.

10 Shao CH，Chen SL，Dong TF，et al.Transplantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after regional hepatic irradiation ameliorates thioacetamide-induced liver fibrosis in rats.J Surg Res，2014，186：408-416.

11 Yuan SF，Jiang T，Sun LH，et al.Use of bone mesenchymal stem cells to treat rats with acute liver failure.Genet Mol Res，2014，13：6962-6980.

12 Amer ME，El-Sayed SZ，El-Kheir WA，et al.Clinical and laboratory evaluation of patients with end-stage liver cell failure injected with bone marrow-derived hepatocyte-like cells.Eur J Gastroenterol Hepatol，2011，23：936-941.

13 Peng L，Xie DY，Lin BL，et al.Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in liver failure patients caused by hepatitis B：short-term and long-term outcomes.Hepatology，2011，54：820-828.

14 Mohamadnejad M，Alimoghaddam K，Mohyeddin-Bonab M，et al.Phase 1 trial of autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in patients with decompensated liver cirrhosis.Arch Iran Med，2007，10：459-466.

15 Mohamadnejad M，Namiri M，Bagheri M，et al.Phase 1 human trial of autologous bone marrow-hematopoietic stem cell transplantation in patients with decompensated cirrhosis.World J Gastroenterol，2007，13：3359-3363.

16 Lyra AC，Soares MB，da Silva LF，et al.Feasibility and safety of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with advanced chronic liver disease.World J Gastroenterol，2007，13：1067-1073.

17 Maeda M，Takami T，Terai S，et al.Autologous bone marrow cell infusions suppress tumor initiation in hepato-carcinogenic mice with liver cirrhosis.J Gastroenterol Hepatol，2012，2：104-111.

18 Wu XZ，Chen D.Helicobacter pylori and hepatocellular carcinoma：correlated or uncorrelated？J Gastroenterol Hepatol，2006，21：345-347.

19 Wollert KC，Meager GP，Lotz J，et al.Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction；the BOOST randomized controled clinical trial.Lancet，2004，364：141-148.

20 陈卫中，倪宗瓒，潘晓平，等.用ROC曲线确定最佳临界点和可疑值范围.现代预防医学，2005，32：729.

21 孔凡东，潘明新，王海澜.骨髓干细胞在大鼠移植肝中的诱导分化.南方医科大学学报，2007，27：468-470.

22 Tosh D，Slack JM.How cells change their phenotype.Nature Rev Mol Cell Biol，2002，3：187-194.

23 Pan XN，Zheng LQ，Lai XH.Bone marrow-derived mesenchymal stem cell therapy for decompensated liver cirrhosis：A metaanalysis.World J Gastroenterol，2014，20：14051-14057.

24 Illa X，Vila S，Yeste J，et al.A novel modular bioreactor to in vitro study the hepatic sinusoid.PLoS One，2014，9：e111864.

25 Krag A，Bendtsen F，Henriksen JH，et al.Low cardiac output predicts development of hepatorenal syndrome and survival in patients with cirrhosis and ascites.Gut，2010，59：105-110.

26 Montoliu S，Balleste B，Planas R，et al.Incidence and prognosis of different types of functional renal failure in cirrhotic patients with ascites.Clin Gastroenterol Hepatol，2010，8：616-622.

（本文编辑：赖荣陶）

“ECHO临床病例征集项目”通知

为提高对肝硬化导致的高血氨症及肝性脑病的临床诊疗水平，从而改善对肝硬化患者的管理，上海市感染性疾病科临床质量控制中心和《肝脏》杂志社与卫材（中国）药业有限公司合作设立“ECHO临床病例征集项目”，病例征集范围为肝性脑病（轻微型肝性脑病/显性肝性脑病）或肝源性高血氨症患者，旨在进一步推进肝功能衰竭及肝硬化治疗的发展，为中青年医师提供学术交流的机会。

本项目从9月1日开始进行相关病例征集（病例制作为PPT格式）；11月30日病例征集截止。由评委团初评12位参赛选手，进入12月上旬在上海举行的ECHO病例征集演讲比赛。最终评选出一等奖1名，二等奖2名，三等奖3名。冠军选手将获得2016年AASLD或类似海外会议全程赞助。

参赛病例发送至《肝脏》杂志社官网http：//hepatoday.org。我们诚挚邀请您的参与，并给予宝贵意见和建议。

上海市感染性疾病科临床质量控制中心

《肝脏》杂志社

卫材（中国）药业有限公司

2015年8月

Study on the influencing factors of short-term prognosis in HBV-related cirrhosis patients treated with bone marrow mesenchymal stem cells transplantation

ZHENG Lian-qiu，PAN Xing-nan.Clinical Liver Center，180thHospital of People’s Liberation Army，Quanzhou 362000，China

Objective To investigate the prognostic factors for hepatitis B liver cirrhosis（HBV-LC）patients treated with bone marrow-derived mesenchymal stem cells（BM-MSC）transplantation.Methods Seventy-nine patients with HBVLC were enrolled as treatment group to accept BM-MSC transplantation combined with anti-viral and liver protection therapy，while control group only received anti-viral and liver protection therapy.Then treatment and control group were matched 1∶1 on the bases of the model for end-stage liver diseases（MELD）score，age and gender.Complications，biochemistry and coagulation function in treatment group were recorded before and after transplantation，follow-up of which was conducted for 3 years.Results The incidences of preoperative complications of upper gastrointestinal hemorrhage （UGH）and hepatorenal syndrome（HRS）were significantly different between the subgroups of survival and death in treatment group （χ2were 9.278 and 8.365，respectively，P＜0.05），while the incidence of spontaneous bacterial peritonitis in the two subgroups was not significantly different（χ2=0.633，P＞0.05）.Compared with control group，the 3-year survival rate of patients evaluated as Child-Pugh class B and C in treatment group was significantly different.In addition，further research showed that class B subgroup had a higher 3-year survival rate than class C group.The differences of total bilirubin（TBil），MELD score，international normalized ratio（INR）and creatinine（Cr）were significant between the subgroups of survival and death in treatment group.Then these indicators were analyzed with logistic regression analysis and receiver operating characteristic curve analysis，which showed that cases with serum albumin lower than 23.4 g/L，MELD score higher than 18.37，TBil higher than 96.4μmol/L and INR higher than 1.97 had a high risk of death.Conclusion BM-MSC transplantation in treatment of HBV-LC can improve the 3-year survival rate.Preoperative UGH and HRS complications，low serum albumin（Alb）level，and high levels of MELD score，TBil and INR carry high risk of death after BM-MSC transplantation.

Bone marrow-derived mesenchymal stem cells；Hepatitis B liver cirrhosis；Prognosis；Survival rate

2015-02-13）

南京军区医药卫生重点基金课题（07Z021）

362000 福建泉州 解放军第一八○医院肝病中心

潘兴南，Email：xnpancn@163.com