高效液相色谱-串联质谱法同时测定草鱼中6种阳离子染料残留量

惠芸华， 张 璇， 黄冬梅， 王 媛， 于慧娟

(中国水产科学研究院东海水产研究所，农业部水产品质量监督检验测试中心，上海 200090)

孔雀石绿(MG)和结晶紫(LV)均属三苯甲烷类阳离子染料，它们对鱼类的寄生虫病、水霉病等均有很好的疗效，许多国家曾将其作为杀菌剂应用于水产养殖业。该类染料进入鱼体后分别代谢为隐色孔雀石绿(LMG)和隐色结晶紫(LLV)，由于这两种化合物及其代谢物均具有潜在的致畸、致癌、致突变等副作用，近20年来许多国家陆续将其列为水产养殖行业的禁用药物[1,2]。亚甲基蓝(MB)是一种人工合成的噻嗪类阳离子染料，是首例用于治疗疾病的人工合成的化学品，它曾成功用于治疗细菌性疟疾。亚甲基蓝对防治淡水鱼的红嘴病、水霉病、小瓜虫病等有很好的疗效，由于其毒性比孔雀石绿低，近年来作为孔雀石绿等禁药的替代品在水产品养殖中得到了广泛应用[3]。新亚甲基蓝(NMB)又名碱性蓝24，与亚甲基蓝性质用途相同，但目前只用于作为染料和传感器等方面的应用。由于亚甲基蓝对动物体有毒性并有致突变作用，在美国、日本禁止用于水产养殖[4,5]。

目前，文献报道与MG、LMG、LV、LLV、MB相关的主要检测方法有液相色谱法[6 - 9]、液相色谱-质谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[11，12]、毛细管电泳法[13]、免疫法[14]。而同时测定这5种物质的方法未见报道，并且尚无MMB相关测定方法的报道。本实验旨在建立水产品中的孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物，以及亚甲基蓝和新亚甲基蓝的高效液相色谱-串联质谱法，研究采用液-液萃取和固相萃取相结合的方法净化样品，并对检测和分离参数进行优化研究。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

TSQ Quantum Access液-质联用仪；美国Millipore公司超纯水仪；Thermo高速离心机；Supelco公司固相萃取装置。

孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、有色孔雀石绿内标(MG-D5)、隐色孔雀石绿内标(LMG-D6)，均购自德国Dr Ehrenstotfer 公司；亚甲基蓝、新亚甲基蓝购自美国Sigma-Aldrich Fluka 公司；甲醇、乙腈、二氯甲烷均为色谱纯；乙酸铵为优级纯；盐酸羟胺、甲酸、对甲苯磺酸均为分析纯；水为超纯水。

草鱼购自上海市农贸市场。去鳞去皮，取背部肌肉，充分绞碎、混匀，-18 ℃保存，备用。

1.2 实验方法

1.2.1提取称取5 g(精确至0.01 g)草鱼样品于50 mL离心管内，加入乙腈15 mL，旋涡混匀1 min，超声提取10 min，4 000 r/min离心5 min，上清液转移至100 mL离心管中。向残渣中加入盐酸羟胺溶液1.5 mL，对-甲苯磺酸溶液2.5 mL，乙酸铵缓冲溶液(pH=4.5)5 mL，乙腈10 mL，旋涡混匀1 min，超声提取10 min，4 000 r/min离心5 min，上清液转移至100 mL离心管中，重复该提取步骤一次，合并上清液。

1.2.2分离净化在上述100 mL离心管中加入10 mL水、2 mL二甘醇、15 mL二氯甲烷，剧烈振荡2 min，4 000 r/min离心5 min，将下层溶液转移至100 mL梨形瓶中，继续在100 mL离心管中加入乙腈5 mL、二氯甲烷10 mL，振荡2 min，4 000 r/min离心5 min，将下层溶液合并至100 mL梨形瓶中，继续在100 mL离心管中加入15 mL二氯甲烷，振荡2 min，4 000 r/min离心5 min，合并至100 mL梨形瓶中，40 ℃ 旋转蒸发至近干，用5 mL乙腈溶解残渣，待净化。

中性氧化铝不会吸附目标分析物，可以过滤掉提取过程中带进来的油脂，避免油脂进入色谱系统，损坏色谱柱。将中性氧化铝柱安装在固相萃取装置上，用5 mL乙腈活化，转移残渣溶解液到柱上，同时用50 mL梨形瓶接收流出液，再用乙腈洗梨形瓶两次，每次2.5 mL，依次过柱，接收合并至50 mL梨形瓶中，40 ℃旋转蒸发至干。向梨形瓶中加入乙腈1.0 mL，超声1 min溶解残渣，再加入1.0 mL乙酸铵溶液(pH=4.5),超声1 min溶解残留物，过0.22 μm滤膜，供液质联用仪测定。

1.3 色谱-质谱条件

色谱条件:色谱柱：CAPCELL PAK MGII-C18柱(100×2.0 mm，5 μm)。流动相：A:2 mmol/L 乙酸铵溶液(含0.1%甲酸)，B：甲醇，C：乙腈。流速：0.4 mL/min。梯度洗脱程序如下：0～30 min,75%A-20%B-5%C;3.0～3.01 min,2%A-20%B-78%C,保持至10.0 min;10.0～10.1 min,75%A-20%B-5%C,。进样量：25 μL。柱温：30 ℃。质谱条件:电喷雾正离子模式(ESI+)，喷雾电压4 500 V，毛细管温度300 ℃，鞘气压力20 kPa，辅助气压力5 kPa，碰撞气(Ar)压力1.5 Pa。SRM优化参数列于表1。

表1 6种化合物的母离子、子离子及碰撞能量

*quantitative ion.

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

普通的C18填料的柱子就可以有效地将孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝、新亚甲基蓝与样品基质分离，实验中采用CAPCELL PAK MGII-C18作为分离这6种物质的色谱柱，结果表明分离效果和灵敏度都比较理想。

2.2 流动相的优化

实验以乙酸铵、甲醇和乙腈作为流动相进行等度洗脱，结果表明6组分的分离效果不好，且有严重的拖尾现象。改用梯度洗脱，并且在乙酸铵中加入0.1%的甲酸，分离效果理想，拖尾现象得以明显改善。故流动相采用含0.1%甲酸的乙酸铵-甲醇-乙腈，梯度洗脱。优化梯度洗脱条件见1.3节。

2.3 质谱条件的优化及定性、定量离子的选取

将浓度分别为1 μg/mL的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝、新亚甲基蓝的单一标准溶液注入质谱仪中，在m/z150～500范围内以正离子模式进行一级质谱全扫描，确定孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝、新亚甲基蓝的分子离子峰；以各个分子离子峰为母离子，对离子源参数(喷雾电压、鞘气、辅助气、源内碰撞诱导解离电压)进行优化，确定最佳离子源测定参数；然后在不同碰撞能量下分别对目标化合物进行二级全扫描，以确定目标化合物的主要离子碎片，选取离子丰度较高、干扰较小的碎片离子作为目标化合物的定性离子和定量离子，如表1所示。

2.4 方法的评价

2.4.1方法的线性范围将孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝、新亚甲基蓝配制成不同浓度的标准溶液，进行分析，以待测物与内标物的峰面积比(y)为纵坐标，待测物的质量浓度(x)为横坐标作线性回归分析。孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝、新亚甲基蓝在1～500 ng/mL的范围内呈良好的线性关系，相关系数均大于0.9990。

2.4.2方法准确度和精密度按1.2节方法对不含目标分析物的草鱼样品进行加入回收试验，添加水平为0.2、2.0、10.0 μg/kg，每个加标水平做6个平行，6种待测物的加标回收率及精密度(RSD)结果见表2。孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝、新亚甲基蓝在草鱼样品中添加水平为0.2、2、10 μg/kg时，平均回收率在75.0%～98.5%之间，RSD为3.2%～9.1%，可见该分析方法准确度高，重现性好，满足药残检测的要求。

表2 回收率和精密度结果(n=6)

2.4.3方法的定量限经实验测得孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝、新亚甲基蓝在加标量为0.2 μg/kg时，平均回收率均大于75.0%，精密度均小于10%，信噪比大于10，因此将0.2 μg/kg定为孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝和新亚甲基蓝的定量限。

3 结论

该方法的建立不仅填补了国内孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫、亚甲基蓝、新亚甲基蓝残留残留同时检测的空白，而且对于结晶紫、隐色结晶紫和新亚甲基蓝的毒性研究具有积极的作用。