毛细管电泳技术对手性药物西酞普兰的拆分方法研究

刘慧青， 李爱梅， 徐中其

(东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620)

手性是自然界很多化合物具有的普遍特性。临床上常用的药物中高达62%是手性药物，大多以外消旋体形式供药。通常来说，手性药物的对映异构体在人体内大多情况下会表现出不同的疗效和毒理性，对映体之一具有活性和治疗性，另外一个则是非活性，甚至具有毒副作用[1]。因此，拆分并测定手性药物异构体成为临床学和生命科学中的一个重要问题。常见的药物手性拆分方法有经典结晶法、动力学拆分法和色谱分离法等。近年来色谱分离法已成为药物分析检验中应用极为广泛的拆分方法[2,3]，但存在费用昂贵和分析时间长等缺点。毛细管电泳(CE)直接拆分手性对映体，凭借其分离效率高、分析时间短、溶剂消耗少、方法灵活和仅需微量样品等优点得到迅速发展，被日益广泛的应用于手性药物拆分领域[4 - 6]。

图1 CIT两对映体的结构式

选择性5-羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂(Selective Serotonin Reuptake Inhibitor,SSRI)是一类抗抑郁药的总称，主要用于治疗抑郁症、焦虑症、强迫症及神经性厌食症。西酞普兰(Citalopram，CIT)是SSRI的一种(结构式见图1)，其对5-HT再吸收抑制作用强、选择性高[7]。CIT以消旋体化合物的形式存在，药理学研究证实，CIT的(S)-对映体依他普仑(Escitalopram)是消旋体CIT产生5-HT再摄取抑制作用的原因，依他普仑在体内对5-HT再摄取的抑制作用是(R)-CIT的167倍。单一对映体形式的依他普仑已上市，因此，开发高灵敏的手性分析方法具有现实意义。目前，CIT的CE手性拆分方法中使用的拆分试剂主要是糖类物质，特别是环糊精及其衍生物[8,9]。Mandrioli等以1%(m/V)磺化β-环糊精和0.05%(m/V)β-环糊精为手性拆分剂，应用CE技术开发了CIT手性拆分方法，6 min内实现手性分离，检测限0.15 μg/mL[10]。Sungthong等将0.5 mg/mLβ-环糊精和22 mg/mL磺化β-环糊精添加到缓冲液中，应用CE技术开发了检测(S)-CIT中杂质组分((R)-CIT、(R)-Citadiol、(S)-Citadiol)的方法，各杂质的定量限均为2.5 μg/mL[11]。本文采用磺化β-环糊精为手性选择剂，对CIT光学异构对映体S-CIT和R-CIT进行CE法拆分，考察了各实验条件对拆分效果的影响，并初步探讨了手性试剂羟乙基β-环糊精、β-环糊精和磺化β-环糊精的拆分机理。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

P/ACE MDQ型毛细管电泳系统(Beckman)。

CIT消旋体购自上海麦仓生物科技有限公司；来士普成品药((S)-CIT·HBr)购自伦贝克公司(丹麦哥本哈根)。β-环糊精(β-CD)、甲基β-环糊精(M-β-CD)、羟乙基β-环糊精(HE-β-CD)、羧甲基β-环糊精(CM-β-CD)和磺化β-环糊精(S-β-CD)，均购自Sigma-Aldrich；柠檬酸、H3PO4、NaH2PO4和Na2PO4、NaOH，均购自中国国药集团。试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2 溶液的配制

储备溶液：准确称取一定量的消旋体西酞普兰，用超纯水定容，配成0.20 g/L标准储备液，将储备液置于冰箱中保存，每次使用之前用超纯水稀释到相应的浓度。缓冲溶液：配制柠檬酸缓冲溶液，按照需要加入不同量的柠檬酸和手性拆分剂，用1 mol/L NaOH溶液调节pH，最后定容。样品溶液：取2粒依他普仑药片(来士普，标准规格为10 mg(S)-CIT·HBr/tablet)，称重为0.2590 g，将药片用研钵研碎，称取0.1208 g依他普仑用约60 mL超纯水溶解，超声10 min，定容至100 mL。12 000 r/min离心10 min后，取上清液过滤后，备用(其中(S)-CIT·HBr的含量为100.0 μg/mL)。

1.3 毛细管电泳操作条件

弹性石英毛细管柱总长度为50 cm，其有效长度40 cm，内径为75 μm(河北永年锐沣色谱器件有限公司)。毛细管首次使用时依次用甲醇冲洗10 min，超纯水冲洗5 min，1 mol/L NaOH溶液冲洗30 min，超纯水冲洗5 min。每次实验前依次用超纯水冲洗3 min，缓冲溶液冲洗3 min，再进行样品的分离。

检测条件：样品浓度为10 μg/mL，采用0.5 psi持续5 s进样，分离电压+20 kV。毛细管温度采用液冷方式控制在25 ℃，紫外检测波长设定为205 nm。

2 结果与讨论

2.1 电泳分离条件的优化

2.1.1缓冲溶液的选择本实验在固定手性拆分剂S-β-CD为0.04%(m/V)的条件下，研究了柠檬酸、Na2HPO4-H3PO4和Tris-H3PO4缓冲溶液对CIT的两个对映体分离效果的影响。结果发现，在柠檬酸缓冲体系中，迁移时间较快，且有较好的分离度和峰形，分离效果较理想。选择柠檬酸体系作为缓冲溶液。

2.1.2缓冲溶液pH值的选择毛细管电泳中缓冲溶液pH值是非常重要的参数之一。本实验考察了pH=4～7范围内，CIT对映体分离的变化，结果见图2。分离度(RS)随着pH的减小而增大，这可能是pH减小使得毛细管中的电渗流淌度降低，从而延长对映体与手性拆分剂在毛细管内的作用时间，最终提高对映体的RS。但是当pH小于5.50时，缓冲能力急剧降低且分析时间延长。考虑到pH为5.50时已有足够的RS，最终确定柠檬酸缓冲溶液的pH值为5.50。

2.1.3缓冲溶液浓度的选择实验固定pH=5.50和手性拆分剂S-β-CD为0.04%，考察了柠檬酸缓冲溶液浓度在10～50 mmol/L范围内变化对分离效果的影响(图3)。结果表明，增大缓冲溶液浓度会使毛细管电渗流下降，但同时CIT有效淌度增大且RS降低，因此应尽量选择较低的浓度。考虑到柠檬酸浓度为10 mmol/L时缓冲能力较差，最终优化的缓冲溶液浓度为20 mmol/L。随柠檬酸浓度的增大，CIT有效淌度增大而两个对映体的分离度降低。其原因可能是CIT两个对映体和拆分剂动态结合后的两非对映体与柠檬酸发生了相互作用，增大柠檬酸浓度使非对映体有效淌度增大并减小了两种非对映体的差异，从而导致其RS降低。

2.1.4手性拆分剂的选择实验考察了不同手性试剂对CIT两对映体电泳分离的影响。分别采用环糊精衍生物(S-β-CD、M-β-CD、H-β-CD、HE-β-CD和CM-β-CD)、胆酸盐(胆酸钠、脱氧胆酸钠、去氢胆酸钠、牛磺胆酸钠)和糖肽类抗生素(万古霉素、替考拉宁)作为手性拆分剂，改变拆分剂的浓度和缓冲溶液pH值，结果见图4。实验表明：四种胆酸盐和两种抗生素对CIT没有拆分能力；只有部分环糊精衍生物对CIT具有手性拆分能力，其中拆分能力顺序为：S-β-CD>HE-β-CD>H-β-CD。这很可能是由于HE-β-CD的侧链长度大于H-β-CD，具有调节性更好的空腔，因此拆分能力更大；S-β-CD由于共轭作用的影响，使O具有更强的电负性，因此与杂原子形成的氢键更强；且CIT的呋喃环是刚性结构，因此O、F、N的位置相对固定，能和S-β-CD形成更强的氢键相互作用，进而S-β-CD表现出很强的手性拆分能力[12,13]。因此，选择S-β-CD作为手性拆分剂。

图2 pH值对手性拆分效果的影响

图3 缓冲溶液浓度对手性拆分效果的影响

2.1.5手性拆分剂浓度的选择手性药物分离中，一般手性拆分剂的浓度越大拆分效果越好，即RS越大。本实验在缓冲溶液中添加0.005%～0.1%(m/V)的S-β-CD，考察了拆分剂浓度对CIT手性分离的影响，结果如图5所示。当缓冲溶液中S-β-CD浓度由0.005%增大到0.04%时，CIT的两个对映体分离度逐渐变大；当S-β-CD浓度继续增大至0.01%时，(S)-CIT和(R)-CIT分别在电渗流(EOF)前后出峰。这是因为CIT的pKa约为9.5，在pH=5.50的柠檬酸缓冲溶液中呈阳离子；而S-β-CD在该柠檬酸缓冲溶液中呈阴离子，两者在电场中移动方向相反。因此CIT的两个对映体与拆分剂S-β-CD动态结合后，使其有效淌度变小甚至反向。由于两个对映体与拆分剂的平衡常数不同，当手性拆分剂浓度在一定范围内时，使得两个对映体与拆分剂S-β-CD动态结合后整体分别带相反电荷，并在EOF两侧出峰。综合考虑以上因素，本实验选择拆分剂浓度为0.04%，在此条件下CIT的两对映体可以获得较好的分离度。

图4 手性拆分剂对手性拆分效果的影响

图5 S-β -CD浓度对手性拆分效果的影响

2.2 方法学考察

2.2.1方法的重现性和检出限在优化后的检测条件下，将CIT两个对映体连续5次进样，考察方法的重现性和选择性。(S)-CIT和(R)-CIT迁移时间的相对标准偏差(RSD)分别为0.8%、1.6%，峰面积的RSD分别为2.2%、2.9%；分离度(RS)为8.62。以信噪比(S/N)=10计算出两个对映体的定量限(LOQ)均为0.3 mg/L，以S/N=3计算检出限(LOD)均为90 μg/L。

2.2.2方法的线性关系用对映体浓度分别为0.050、0.10、0.25、0.50、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L的混合标准溶液，在上述优化后电泳条件下，对每个浓度重复进样两次，结果表明两个对映体浓度在0.05～100 mg/L范围内线性关系良好，其回归方程分别为：(S)-CIT：Y=31.62X+12.92，R2=0.999；(R)-CIT：Y=32.24X+17.78，R2=0.998。

2.3 来士普药片的分析

2.3.1对映体的定性及光学纯度的测定通过向20 μg/mL消旋体CIT中添加0～50 μg/mL不同浓度的(S)-CIT，在优化检测条件下对该系列样品进行检测。结果如图6所示，随(S)-CIT浓度的增加，第一个峰逐渐增大，表明迁移时间短的是(S)-CIT，与文献报道相符。

以依他普仑药片经处理后的溶液(按标准规格计算，(S)-CIT·HBr为100 μg/mL)为样品，对该样品进行分离测定(图7)。结果表明，药品中(R)-CIT的含量为总量的1.27%，对映体过剩百分数为97.5%，符合要求。

图6 对映异构体的定性

图7 药品光学纯度的测定

2.3.2含药量和回收率将处理好的样品(100 μg/mL(S)-CIT·HBr)稀释10倍，在优化实验条件下对该样品进行分析(重复3次)，并通过标准工作曲线计算出浓度，最后计算实际含药量为标准规格。继而向该稀释样品中添加20.0 μg/mL CIT(重复3次)，测定两个对映异构体的回收率，结果见表1。

表1 来士普成品药中的含药量及回收率(n=3)

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3 结论

以S-β-CD作为手性选择剂对西酞普兰对映体进行毛细管电泳拆分，通过对分离条件的优化，建立了具有分析时间短、重现性好和灵敏度高等特点的毛细管电泳拆分方法。该方法减少了拆分剂磺化β-CD的使用浓度，具备了更加灵敏的定量检测能力，更加适合于西酞普兰对映体的拆分分析。