高效液相色谱-柱后衍生法测定东盟水果中氨基甲酸酯类农药残留

吕 平， 杜国冬， 韦丽君， 黄 强*， 农耀京， 吕丽兰

(1.广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西南宁 530001；2.农业部亚热带果品蔬菜质量监督检验测试中心，广西南宁 530001；3.广西亚热带优势作物繁育及综合开发新技术重点实验室，广西南宁 530001)

氨基甲酸酯类农药是一类广谱性农药，其杀虫效果好，具有高效、低毒、选择性高和持效期长等特点[1]。目前，中国与东盟农产品贸易越来越频繁，因此，对东盟水果中的氨基甲酸酯类农药的检测就显得十分重要。国内现有检测氨基甲酸酯类农药的方法有很多，主要有薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法和高效液相色谱-质谱法等[2 - 4]。采用气相色谱法或气相色谱-质谱法，高温气化部分化合物可能分解，干扰物多；高效液相色谱-质谱法灵敏度高，检测效果好，但其设备昂贵，普通的实验室无法满足该要求。

利用高效液相色谱-柱后衍生技术，使氨基甲酸酯类化合物经过衍生生成具有荧光的物质，通过荧光检测器检测，可以大大提高灵敏度，降低分析成本。本实验通过对东盟水果提取体系以及净化方法进行研究，建立了检测东盟水果中氨基甲酸酯类农药残留的分析方法，为农产品的生产和安全监督提供理论依据和参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

2695型高效液相色谱仪(美国，Waters公司)，配荧光检测器；R215型旋转蒸发仪(瑞士，Buchi公司)；T18型高速均质仪(德国，IKA 公司)；固相萃取柱(1 000 mg/6mL)：氨基小柱、弗罗里硅柱和石墨化炭黑柱(美国，安捷伦公司)。

7种氨基甲酸酯类农药标准品：涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、克百威和甲萘威，均购自农业部环境监测所，纯度99%；邻苯二甲醛(OPA)、巯基乙醇(Thioflour)、OPA稀释液(CB910)、0.05 mol/L NaOH溶液(CB130)，均为美国Pickering公司提供。甲醇、乙腈、二氯甲烷、丙酮(色谱纯)；NaCl、乙酸乙酯(分析纯)。实验用水由MilliQ 纯水发生器(美国Bedford公司)制备。

1.2 实验方法

1.2.1衍生试剂的配制称取100.0 mg衍生试剂OPA，甲醇溶解，放入950 mL OPA 稀释液中，超声2.0～5 min。称取2.0 g巯基乙醇，用少量OPA 稀释液溶解，混匀到上述OPA稀释液，现配现用。

1.2.2液相色谱条件色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C8柱(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水，梯度洗脱，流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

1.2.3衍生条件柱后衍生：0.05 mol/L CB130碱液、CB910溶液(OPA)，流速：0.30 mL/min；衍生池温度：100 ℃；发射波长465 nm、激发波长330 nm。

1.2.4标准溶液配制分别称取7种氨基甲酸酯类农药标准品各0.0100 g(精确到0.0001 g)，用甲醇分别定容配成100 mg/L的标准储备溶液。

1.2.5样品处理东盟水果包括芒果、荔枝、龙眼、香蕉、榴莲、山竹、菠萝、火龙果、番荔枝、蛇皮果、红毛丹、木菠萝，用四分法[5]取可食部分，粉碎匀浆。称取25.00 g(精确至0.01 g)样品放入高型烧杯中，加入50.0 mL提取剂，高速匀浆2 min，过滤，滤液收集到装有7.0～8.0 g NaCl的具塞量筒中，剧烈震荡1～2 min，室温静置30 min，分层后准确吸取10.0 mL提取液到平底烧瓶中，旋转蒸发皿浓缩至近干，待净化。

取固相萃取小柱，先用5 mL甲醇-二氯甲烷淋洗液预淋柱，当溶剂液面到达柱吸附表面时，加入待净化溶液，离心管收集洗脱液，用4 mL淋洗液洗脱，重复3次。水浴上用氮吹仪浓缩至近干，甲醇准确定容于5.00 mL，过0.45 μm滤膜，上机测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择与优化

2.1.1色谱柱选择对Agilent Eclipse XDB-C8柱及Agilent Eclipse XDB-C18柱进行试验。结果表明，采用Agilent Eclipse XPB-C8色谱柱，7种氨基甲酸酯标样峰形好，其响应值、分离度也较好，杂质干扰较少，因此选其作为分离柱。

2.1.2检测波长的确定对氨基甲酸酯标准品(1.00 mg/L)，参考文献方法[6，7]中测定蔬菜、水果中氨基甲酸酯的波长，同时经高效液相色谱仪测试不同组合波长，发现在发射波长465 nm、激发波长330 nm时其峰高、峰面积最佳，经测试其基质空白干扰较少，色谱图较理想，因此选择该组波长作为氨基甲酸酯的检测波长。

2.1.3流动相的选择对氨基甲酸酯标准品及其基质空白分别进行了甲醇-水、乙腈-水，以及甲醇、乙腈、水3种不同比例的测试，以确定最佳流动相的组合及配比。由实验可知，甲醇或乙腈或甲醇和乙腈与水无论以何种比例等度洗脱，都不能很好分离全部目标物，分离度差；甲醇或乙腈或甲醇和乙腈与水梯度组合成流动相，合适的比例所有的目标物都能很好的分离，但乙腈对人体毒性大。综合考虑以甲醇与水组成流动相，梯度洗脱按表1进行，该条件下能够很好的对7种氨基甲酸酯进行分离，出峰的时间较理想，在25 min内所有的目标组分全部洗脱出。7种氨基甲酸酯标样液相色谱图见图1。

表1 流动相梯度洗脱条件

图1 7种氨基甲酸酯类农药混合标样色谱图(浓度：0.100 mg/L)

2.2 提取溶剂的选择

在添加量为0.10 mg/kg 的东盟水果样品中，分别加入50.0 mL乙腈、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯4种提取溶剂进行比较实验，结果表明乙酸乙酯的提取回收率低，效果较差；二氯甲烷的干扰杂质多，峰形不好；丙酮的提取回收率低于乙腈；乙腈的回收率在96.8%～103.5%之间，杂质干扰少，效果好。因此，选择乙腈作为提取溶剂。

2.3 净化条件的选择

2.3.1洗脱小柱的选择选用石墨化炭黑、弗罗里硅土和氨基小柱进行比较，结果表明石墨化炭黑能够很好吸收色素，杂质明显少于其他两种，但其回收率低，在58.8%～67.9%之间。这可能是吸附力强，部分目标化合物吸附后未洗脱出；氨基小柱的净化效果好，回收率均达90%以上，杂质干扰也较少，弗罗里硅土小柱回收率偏低。因此，选择氨基萃取小柱为净化载体。

2.3.2淋洗液比例和用量的选择分别配制体积比为1∶99、2∶98、5∶95、10∶90和15∶85不同比例的甲醇-二氯甲烷进行洗脱试验。综合考虑回收率和净化效果，选用甲醇-二氯甲烷(5∶95，V/V)作为洗脱液。用选定的淋洗液洗脱，分段收集并测定洗脱液中目标物的含量，根据实验结果，选定淋洗体积为10 mL，以2 mL、4 mL和4 mL分3次洗脱。

2.4 标准曲线的建立及检出限的确定

按1.2.4条件配制 7种氨基甲酸酯标准品的0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L标准系列溶液，在选定条件下测定，以峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线，并进行回归分析，检出限按信噪比(S/N)=3计算。结果见表2。

表2 7种氨基甲酸酯类农药残留的保留时间、回归方程、线性范围、相关系数(R2)和检出限

2.5 添加回收率与精密度

向芒果、荔枝和龙眼样品中添加7种氨基甲酸酯的标准溶液，考察方法的准确度和精确度。结果表明，当添加浓度为0.10～0.50 mg/kg时，7种氨基甲酸酯三个浓度水平的平均添加回收率在80.7%～107.7%之间，变异系数在0.5%～8.8%之间，说明该方法完全符合农药残留分析的要求[8]。

2.6 东盟水果样品检测

对南宁市、崇左市部分批发市场及超市的100个东盟水果样品进行了7种氨基甲酸酯类农药残留的检测，均未检出此类农药，表明该类农药目前在东盟水果中控制较好。

3 结论

本实验建立了高效液相色谱-柱后衍生法同时测定东盟水果中7种氨基甲酸酯类农药残留。方法具有操作简便、净化及分离效果好、价格低廉、定性及定量准确、重现性好等优点，适合东盟水果中氨基甲酸酯的残留分析。