罗丹明类染料-磷钼酸复合纳米微粒的合成、表征及应用

潘宏程， 朱俊杰, 姜立萍*

(生命分析化学国家重点实验室，南京大学化学化工学院，江苏南京 210093)

罗丹明类染料因具有光稳定性好、荧光量子产率高，以及三线激发态形成程度较低等优点，在化学与生物分析领域得到了较为广泛的应用[1，2]。利用该类染料与金属离子形成离子缔合物，发展了一系列测定金属离子的萃取光度法和催化光度法[3，4]。利用罗丹明染料的荧光特性可建立高灵敏的荧光光度法[5，6]，也可以通过氧化活化使荧光增强，用于测定金属离子[7]。

罗丹明类染料在水溶液中带正电荷，能与磷钼酸(PMA)根阴离子结合生成离子缔合物。PMA与罗丹明B(RhB)、丙酮、明胶、聚乙烯醇等形成的有机溶剂胶束包合络合物在592 nm波长处显色，可用于微量磷的测定[8]。刘保生等[9]利用十二烷基苯磺酸钠存在下，吖啶橙-罗丹明6G(R6G)发生有效能量转移，使R6G的荧光大大增强，而酸性条件下PMA与R6G形成的离子缔合物使R6G的荧光猝灭，从而建立了测定痕量磷的能量转移荧光法。蒋治良等[10]发现在硫酸介质中，PMA与罗丹明S形成的缔合物在610 nm处的共振光散射急剧增强，表明PMA-罗丹明S缔合物有可能形成微纳米级的结构。在疏水作用力和静电引力下，罗丹明类染料与PMA形成离子缔合物后能进一步形成大的微粒。罗丹明类染料分子聚集在缔合物微粒中产生强烈的电子耦合效应，导致共振增强的光散射现象。这类有机-无机杂化复合纳米材料表现出优异的光电性能和生物亲和性，为高灵敏度的化学与生物分析提供了崭新的研究思路。但是与其广阔的应用前景相比，罗丹明类染料-PMA复合纳米材料的制备和性能的研究还相当匮乏。

本研究制备了R6G -PMA和RhB-PMA复合纳米微粒，并用扫描电镜(SEM)、紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱、荧光光谱、共振光散射(RLS)光谱对复合纳米微粒进行了表征。制备了R6G -PMA修饰玻碳电极(R6G -PMA/GCE)，并研究了H2O2在R6G -PMA/GCE上的电化学行为，建立了一种测定H2O2的计时电流分析新方法。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

GHI660B电化学工作站(上海辰华仪器有限公司),采用三电极系统:R6 G-PMA/GCE(Φ=3 mm)为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂柱电极为对电极。TGL-16型高速离心机(江苏金坛市中大仪器厂)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(河南予华仪器有限公司)；KAWH古川9050超声波清洗器；DHG -9140A型电热恒温鼓风干燥箱；8-S1型磁力搅拌器(江苏金坛市环宇科技仪器厂)。

壳聚糖，磷酸盐缓冲溶液(PBS)(0.1 mol/L，pH=7.48)，罗丹明B(RhB)，罗丹明6G(R6G)(上海华蓝化学)；磷钼酸(PMA，国药集团化学试剂有限公司)；抗坏血酸(0.001 mol/L，西陇化工有限公司)；H2O2(0.001 mol/L，西陇化工有限公司)；尿酸(0.001 mol/L，上海华蓝化学)。所用其它试剂均为分析纯以上。实验用水为二次蒸馏水。

1.2 罗丹明类染料-PMA复合纳米微粒的制备

称取0.1 mmol的RhB或R6G于100 mL烧杯中，加入40 mL乙醇，搅拌溶解。再称取0.2 g PMA于另一烧杯中，加入10 mL二次水溶解。当两者分别溶解完全后，迅速混合，于40 ℃恒温水浴中搅拌反应2 h。自然冷却后，以4 000 r/min离心5 min，沉淀用15 mL 50%的乙醇反复洗涤、离心，最后沉淀在40 ℃下烘干4 h，得到暗红色的罗丹明类染料-PMA复合纳米微粒。将干燥后的RhB-PMA和R6G -PMA复合纳米微粒各取0.0065 g，超声分散于5 mL 50%的乙醇中，待用。

1.3 R6G -PMA复合纳米微粒修饰玻碳电极的制备

将玻碳电极(GCE)先用金相砂纸(1#～7#)逐级抛光，再依次用粒度为1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3悬浊液在麂皮上抛光至镜面。每次抛光后先洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次2～3 min，重复三次，最后依次用乙醇(1+1)、HNO3(1+1)和二次水超声清洗后，电极在0.5～1.0 mol/L的H2SO4中用循环伏安法活化(电位扫描范围1.0～-0.2 V)，反复扫描直至达到稳定的循环伏安曲线为止。然后在0.20 mol/L的KNO3溶液中记录在1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]溶液中的循环伏安曲线，以测试电极性能。扫描速度50 mV/s，电位扫描范围-0.2～0.9 V，所得循环伏安曲线中的峰电位差在80 mV以下。

将0.0065 g R6G-PMA复合纳米材料超声分散于5 mL 50%的乙醇中。移取100 μL该溶液与50 μL 1%壳聚糖溶液(溶于1%乙酸)混合均匀。滴加5 μL该混合溶液于已处理好的GCE表面，自然晾干，即得R6G -PMA/GCE。

2 结果与讨论

2.1 扫描电子显微镜表征

图1A为RhB-PMA复合纳米微粒的扫描电镜(SEM)照片。从图中可以看出，RhB-PMA复合纳米微粒表面光滑，呈近似球形和椭球形，堆积成三维有空隙的结构。图1B给出了随机选取的50个RhB-PMA复合纳米微粒的粒径分布图，其平均粒径为343±144 nm。

图1 RhB-PMA复合纳米微粒的SEM图(A)和粒径分布图(B)Fig.1 SEM image (A) and diameter distribution (B) of RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.2 紫外-可见吸收光谱

图2为R6G、RhB、R6G -PMA和RhB-PMA在50%的乙醇中的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱。R6G和RhB的最大吸收峰分别为526 nm和553 nm(图2A)。当R6G、RhB与PMA形成复合纳米微粒时，吸收峰分别红移至562 nm和555 nm(图2B)，表明R6G、RhB与PMA发生了缔合作用。这种作用力可能主要来自R6G、RhB的正电荷与PMA所带负电荷之间的静电引力，以及R6G、RhB分子之间的疏水作用力。

图2 (A)R6G、RhB的紫外-可见光谱；(B)R6G -PMA和RhB-PMA(b)复合纳米微粒的紫外-可见光谱Fig.2 (A)UV-Vis spectra of R6G and RhB;(B)UV-Vis spectra R6G -PMA and RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.3 荧光和共振光散射光谱

R6G -PMA和RhB-PMA复合纳米微粒都表现出优异的荧光性能。R6G -PMA和RhB-PMA纳米微粒的荧光峰分别位于581 nm和580 nm，分别见图3和图4。与相应的罗丹明类染料分子相比(R6G荧光峰为525 nm，RhB荧光峰为550 nm)，复合纳米微粒的荧光峰都发生了红移，这与吸收光谱的结果相符。进一步研究了R6G -PMA和RhB-PMA复合纳米微粒的共振光散射(RLS)效应。结果表明，R6G和RhB溶液的RLS信号很微弱，这是因为R6G和RhB染料分子在溶液中散射截面很小，主要为Rayleigh散射。但是R6G、RhB与PMA缔合后，聚集成几百纳米的微粒，其RLS信号急剧增强，R6G -PMA和RhB-PMA分别在581 nm和654 nm产生最大RLS峰。

根据Parkash等人[11]用量子理论对染料聚集体引起的RLS增强现象的研究，聚集体的尺寸和电子耦合强度是影响RLS的主要因素。R6G -PMA和RhB-PMA复合纳米微粒由于静电引力和疏水作用力而发生聚集，形成粒径可达数百纳米的复合物微球(图1)。在聚集体中，由于罗丹明类染料具有共轭大π键，相邻染料分子之间强烈的电子耦合会导致很强的共振光散射现象。

图3 R6G -PMA复合纳米微粒的荧光(a)和共振光散射(b)光谱Fig.3 Fluorescence(a) and RLS(b) spectra of R6G -PMA hybrid nanoparticles

图4 RhB-PMA复合纳米微粒的荧光(a)和共振光散射(b)光谱Fig.4 Fluorescence (a) and RLS (b) spectra of RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.4 R6G -PMA复合纳米微粒修饰电极的H2O2传感器

采用R6G -PMA复合纳米微粒修饰GCE，构建了一种新型的H2O2电化学传感器。图5A给出了不同浓度的H2O2在R6G -PMA/GCE上的循环伏安图，支持电解质为pH=7的0.1 mol/L PBS。无H2O2时，R6G -PMA/GCE上无明显氧化电流产生；随着H2O2的加入，R6G -PMA/GCE的氧化电流增大。由于裸GCE上H2O2的氧化电流很弱，因此R6G -PMA/GCE对H2O2的氧化有明显的催化作用。

另外，采用计时电流法考察了R6G -PMA/GCE对H2O2的电流-时间(i-t)响应情况(图5B)。在0.9 V工作电位下，R6G -PMA/GCE对H2O2具有快速的响应，信号达到95%的时间小于4 s，且当H2O2浓度在3.3×10-6～5.6×10-5mol/L范围内时呈线性响应(图5C)，其线性方程为:I(μA)=1.366+0.1553c(10-6mol/L)，相关系数r2为0.9921，检出限(3σ)为2.0×10-8mol/L。

同时，进一步考察了常见干扰物质尿酸(UA)和抗坏血酸(AA)对H2O2测定的影响(图5D)。在H2O2浓度为3.3×10-6mol/L时，等量的UA和10倍的AA对H2O2测定的影响<1%。这说明R6G -PMA/GCE对H2O2的测定有较好的选择性。

图5 (A)H2O2在R6G -PMA/GCE上的循环伏安图；(B)R6G -PMA/GCE上持续加入3.3×10-6 mol/L H2O2的i -t响应曲线；(C)催化电流与H2O2浓度的线性关系；(D)尿酸(UA)和抗坏血酸(AA)对H2O2测定的影响Fig.5 (A) Cyclic voltammograms of the R6G -PMA/GCE with different concentrations of H2O2;(B) i -t response curve for successive addition of 3.3×10-6 mol/L H2O2 for R6G -PMA/GCE in 0.1 mol/L PBS(pH=7) at the applied potential of 0.9 V;(C) Plots of the electrocatalytic current vs H2O2 concentration;(D) Effect of uric acid and ascorbic acid on the detection of H2O2

3 结论

合成了R6G -PMA和RhB-PMA两种复合纳米微粒，研究了罗丹明类染料-PMA复合纳米微粒的光学性能，结果表明这一类复合纳米微粒具有非常好的荧光和共振光散射增强效应。罗丹明类染料与PMA通过静电引力和疏水作用力相互结合，形成纳米级的聚集体。在聚集体中，由于罗丹明类染料具有共轭大π键，相邻染料分子之间强烈的电子耦合效应会导致很强的共振光散射现象。这类复合纳米微粒有望成为新型的荧光和RLS探针应用于生物分子检测、免疫标记等领域。我们构建了R6G -PMA/GCE的H2O2电化学传感器。R6G -PMA/GCE对H2O2的氧化有明显的催化作用，并且对尿酸和抗坏血酸有较好的抗干扰能力。