脐带血血清分离培养人胎盘间充质干细胞＊

周心涛，赵黎丙，闵新文，陈 娇，郎明健

(湖北医药学院附属东风医院，湖北十堰 442000)

来源于正常足月分娩胎盘的人胎盘间充质干细胞(human placenta mesenchymal stem cells，PMSCs)具有来源广、免疫原性低等优点，还具有自我更新和无限增殖的能力，能向多谱系分化[1－2]。本实验通过利用正常足月分娩的脐带血清(umbilical cord blood serum，UCBS)分离、培养PMSCs，观察细胞形态、数量、扩增所用时间、细胞周期及培养前后细胞的表型、分化能力的改变，探讨UCBS分离、培养及扩增PMSCs的可能性。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

L-DMEM(Gibco)、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(北京天根生物技术有限公司)，L-谷氨酰胺、MTT kit(Promega)。间充质干细胞成脂、成骨分化试剂盒(广州赛业生物技术有限公司)。

1.2 UCBS 制备

无菌条件下取健康产妇足月脐血，4℃静置4～16 h，20℃、1 500 g离心10 min收集上层血清，0.22 μm滤器过滤，56℃水浴 30 min灭活补体，－20℃保存备用。

1.3 PMSCs分离、培养及扩增

经孕妇本人及家属知情同意、医院伦理委员会批准，无菌条件下取健康胎儿(血清学检查HBV，HCV，HIV和梅毒均为阴性)小块胎盘组织，PBS充分洗涤后剔取胎儿面脱膜并剪碎。0.1% Ⅳ型胶原酶消化15～30 min，100目筛网过滤，收集细胞接种于T75细胞培养瓶，分别以含10%UCBS(实验组)和10%FBS(对照组)的α-MEM培养基于37℃，5%CO2的饱和湿度环境下进行培养。培养生长至80%融合后(1～2周)，用0.05%的胰酶消化传代。

1.4 PMSCs相关鉴定

1.4.1 PMSCs体外诱导分化 将实验组与对照组中生长至第3代的PMSCs，以低密度接种至6孔板，第2天将基础培养液更换为诱导液。成骨诱导液为高糖 DMEM、10%UCBS、地塞米松(10～8 mol/L)、磷酸甘油(10 mmol/L)及抗坏血酸(50 g/mL)。成脂肪细胞诱导液为高糖DMEM、10%UCBS、地塞米松(1nmol/L)、0.5 μmol/L 3-isobutyl-1-methylxantine、5 mg/L胰岛素及200 mg/L吲哚美辛。每2～3 d换液1次。诱导2～4周后，分别用茜素红(成骨细胞)和油红O(脂肪细胞)染色鉴定。

1.4.2 PMSCs表面标志鉴定 将实验组与对照组中生长至第5代的细胞，用0.05%胰蛋白酶消化后，调整细胞密度至1×106/mL，分为每管100 μL，分别加入鼠抗人 CD105(PE，Sigma)、CD34(PE，Sigma)、CD45(CY5，Sigma)、HLA-DR(FITC，Sigma)、CD44(FITC，Sigma)及 CD29(FITC，Sigma)单克隆抗体，避光4℃孵育30 min，4%多聚甲醛固定后流式细胞仪进行检测。

1.5 不同血清对PMSCs增殖活性的影响

MTT法检测不同血清对PMSCs增殖活性的影响，用0.05%胰蛋白酶分别将实验组与对照组中生长至第4代的PMSCs消化成单细胞悬液，调整浓度为104个/mL，每孔100 μL接种于96孔板，每组细胞培养液根据不同的时间点，各设置5个平行孔和一个空白对照。按试剂盒操作指南分别于接种后的第1、3、5、7 天每孔 20 μL加入 MTT工作液。37℃、5%CO2孵育4 h后，用酶标仪在490 nm处测定OD值。

2 结果

2.1 PMSCs的鉴定

2.1.1 PMSCs形态 实验组 PMSCs在2～3 d时开始贴壁生长，贴壁细胞呈梭形，形态饱满，以后细胞数逐渐增多形成漩涡状集落，原代细胞培养1～2周达80%以上融合后可传代。对照组PMSCs在3～4 d时开始贴壁生长，细胞形态与实验组无明显差异。两组细胞传代后生长速度均明显加快，约4 d可传代1次。传代2～3次后细胞纯度提高，形态较原代均一，呈平行排列或漩涡状生长，见图1。

2.1.2 PMSCs体外诱导分化 实验组细胞在进行成骨细胞诱导时，随着诱导的进行，PMSCs由梭形逐渐变成方形，并开始出现聚集。诱导21 d后茜素红染色可以将胞质被染成红色，且实验组茜素红染色阳性细胞明显多于对照组;成脂诱导后PMSCs逐渐开始出现油滴，诱导28 d后油红O染色阳性，实验组与对照组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见图2。

2.1.3 PMSCs表面标志 经流式细胞术检测，无论是实验组还是对照组中，PMSCs都高表达CD29、CD44及CD105，不表达或低表达 CD34、CD45及HLA-DR，差异无统计学意义(P＞0.05)。见图3。

2.2 MSCs在含UCBS培养液中的生长曲线

PMSCs在实验组与对照组中培养时均表现为第2～5天成对数生长，第6～7天后进入平台期，生长变缓，而且实验组的增长率明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)，图4。

3 讨论

PMSCs是从人胎盘组织中分离的一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，除了能分化为脂肪、软骨、成骨细胞等本胚层细胞外，在适当的条件性还能转分化为骨骼肌细胞、心肌细胞、肝细胞及神经细胞等胚层的细胞。PMSCs在缺血性卒中、帕金森氏症及脊髓损伤等各种神经功能障碍疾病模型中的治疗效果已经得到了证实[3]，但常规用于PMSCs体外培养的FBS中含有异源性蛋白及未知的细胞因子，这些蛋白和细胞因子可能会对人体有害，因而影响MSC的临床应用[4]。

图1 实验组和对照组培养PMSCs原代细胞生长形态(40×)Fig.1 The morphology of PMSCs in experimental and control groups

图2 PMSCs体外成骨和成脂诱导分化(200×)Fig.2 Osteogenesis and adipogenesis differentiation of PMSCs in vitro

图3 PMSCs的免疫表型鉴定Fig.3 The immunophenotype identification of PMSCs

图4 PMSCs在两种培养液中的生长曲线Fig.4 The growth curves of PMSCs in the two groups

近年，很多人源性的替代品已经被用来代替动物血清进行干细胞培养，并取得了理想的效果[5]。UCBS比FBS含有更高浓度的细胞因子和生长因子，有利于干细胞扩增，细胞形态更好、免疫原性更低[6－8]。利用UCBS代替FBS培养人骨髓来源的MSC(human bone marrow-derived MSC，BM-MSC)，在连续传代的过程中一直保持MSC的形态和高的增殖活性[9－11]。有学者利用处理过的脐带血浆分离的带间充质干细胞(human umbilical cord-derived MSC，hUC-MSCs)能保持较高的增殖活性和分化潜能[12]，CBS培养的MSC即使在高代数时仍具有较高的克隆形成潜能和MSC相关特性[13]。UCBS培养各种MSC的报道较多，但用于分离PMSCs的报道并不多见。UCBS、PMSCs及 hUC-MSCs同为胎儿附属物，理论上UCBS中所含细胞因子的浓度、比例等应该更适合PMSCs及hUC-MSCs的生长。本研究利用UCBS进行PMSCs的分离培养，并对培养的结PMSCs进行鉴定。结果显示PMSCs在含UCBS的培养液中可稳定生长，显微镜下其形态呈梭形，达到一定的密度后呈漩涡状生长，复苏及传代贴壁率、贴壁时间都正常，在成骨诱导培养液中培养21 d后茜素红染色成棕红色，成脂诱导28 d后油红O染色阳性;流式细胞分析检测其高表达 CD29、CD44 及 CD105，低表达 CD34、CD45 及HLA-DR。PMSCs在含UCBS的培养液中能长期稳定生长，并保持其活力和间充质干细胞特性。而且PMSCs在UCBS培养液中的增殖率明显高于含FBS的培养液。表明UCBS可以替代FBS用于分离、纯化、培养、扩增PMSCs，因人脐带血血浆完全是人源性的，可符合临床对PMSCs的培养要求。

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