检测不同活动期强直性脊柱炎患者外周血Th1、Th2和Treg细胞的意义*

王作龙，钟乃风，马 莉＊＊

(1.贵阳医学院附院中心实验室，贵州贵阳 550004;2.贵阳医学院生物与工程学院生物技术教研室，贵州贵阳 550004)

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种与HLA-B27有明显相关性的全身性自身免疫性疾病，一般以骶髂关节为首发部位，逐渐累及人类各种软骨组织、脊柱及四肢关节[1]。AS发病机制目前尚不清楚，近年来有多种假说被提出，诸如遗传假说、免疫假说、细菌感染假说、DNA甲基化，未折叠蛋白反应假说等[2-3]。免疫系统的异常是自身免疫性疾病发生、发展和预后的中心环节，已有文献报道在AS疾病中，人类T细胞亚群的失衡起关键作用[4]。依据CD4+T细胞分化和功能将其分为辅助性 T细胞 1(Th1)、辅助性 T细胞 2(Th2)，以及发挥负调节功能的调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)等亚群。已有不少研究发现AS患者外周血Th1细胞明显增高和Treg、Th2细胞减低，但同时对Th1、Th2及Treg细胞在AS患者外周血中的检测，报道较少，在AS患者中是否存在Th1/Th2/Treg失衡，以及这种失衡对AS的相关性，本研究通过检测AS患者外周血中Th1(CD3+CD8-INF-γ+)、Th2(CD3+CD8-IL-4+)、Treg(CD4+CD127LOWCD125+)细胞[5]，分析 Th1、Th2、Treg细胞数量改变与AS发生、发展的相关性，以期了解AS的免疫平衡状态，为AS的临床诊断及治疗提供新思路新方法。

1 材料与方法

1.1 研究对象

78例AS患者，男65性例，女性13例，17～53岁，平均(26+7.8)岁，AS疾病的诊断，符合1984年纽约修订标准，HLA-B27均为阳性，均未经任何治疗[6]。排除标准:(1)合并其他慢性病;(2)明显血液学指标异常;(3)其他自身免疫性疾病;(4)免疫抑制类药物治疗史;(5)免疫相关性疾病;(6)肝、肾功能异常。采集标本前，患者均自愿签署知情同意书，填写病例调查表以及Bath AS功能指数(BASFI)、Bath AS病情活动指数(BASDAI)表格。依据Bath AS病情活动指数，将AS组分为低活动性AS组(BASDI＜4分，44例)、高活动性 AS组(BASDI≥4分，34例)，两组间年龄及性别构成差异无统计学意义(P＞0.815)。选取30名健康体检者作为正常对照组，其中男16名、女14名，15～52岁，平均年龄(25±8)岁 ，无HIV感染及重大疾病史。AS组与正常对照组之间性别构成及年龄差异无统计学意义(P＞0.773)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有AS患者及正常对照组受检者均于上午8∶00～10∶00空腹抽取静脉血2～3 mL于EDTA-K2抗凝管中，2 h内用于 Th1、Th2、Treg细胞检测。

1.2.2 细胞体外刺激活化 取上述经EDTA-K2抗凝的静脉血，用淋巴细胞液分离密度梯度离心法获取单个核细胞，用RPMI 1640调整细胞浓度至2×106/mL接种于6孔培养板，加入PMA和Io，使终浓度分别为1和1.7 μg/mL。然后置于37℃的5%CO2细胞培养箱中，刺激培养4～6 h。以上试剂均购自美国BD公司。

1.2.3 CD69的检测 通过检测CD3+CD8-T淋巴细胞膜表面的CD69表达，监测激活效果。当CD69表达＞90%(图1)方可进行Th1、Th2细胞的检测。

1.2.4 Th1、Th2、细胞检测 取两支试管，一个标记为同型对照管，另一个为测试管，分别加入CD3-FITC、CD8-PECy7 抗体各 20 μL，再加入 50 μL 已刺激培养后的全血，混匀，室温避光孵育15 min;溶血，PBS洗涤2次，加入破膜剂1 mL，进行胞内细胞因子染色，分别加入对应抗体标记同型对照(-)及Th1/Th2(+)，混匀，室温避光孵育15 min;PBS洗涤1次后，上机检测。Th1、Th2、细胞的结果分别以 CD3+CD8-IFN-r+、CD3+CD8-IL-4+细胞的百分率表示。

1.2.5 Treg细胞检测 取两支试管，第一管做同型对照并加入IgG1-APC、IgG2a-Alexflour672抗体20 μL，第二管加入 Treg Cocktail(CD4-FITC、CD25-APC、CD127-Alexflour672)20 uL，再分别加入 EDTA-K2抗凝外周血50 μL，混匀，室温避光孵育15 min，其余步骤同 Th1，上机检测。Treg细胞的结果以CD4+CD127LOWCD25+细胞的百分率表示。流式细胞仪为美国BD公司生产的Canto II。

1.3 统计学处理

流式分析数据采用Diva分析软件，统计分析采用SPSS 18.0统计软件。以(±s)表示各组检测指标数据。采用 t检验进行组间比较;采用Pearson相关分析方法进行相关性分析，当|r|＞0.7 时为高度相关，当 0.4≤|r|＜0.7 时为中度相关，当|r|＜0.4时为低度相关。当 P＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

高活动性AS组和AS组外周血Th2细胞均低于低活动性AS组和正常对照组(P均＜0.05，表1、图3)，且高活动性AS组明显低于低活动性AS组(P＜0.01)，差异有统计学意义;而低活动性AS组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。AS组外周血Treg细胞与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);AS低活动性组外周血Treg细胞与健康对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05);AS高活动性组外周血Treg细胞明显低于正常对照组和AS低活动性组，差异有统计学意义(P ＜0.01)。见表1、图4。

表1 AS组及正常对照组外周血Th1、Th2、Treg细胞量的比较(%)Tab.1 Comparison of quantity of Th1，Th2 and Treg cells between the AS group and normal control group in peripheral blood

2.1 外周血中Th1、Th2及Treg亚群

AS组外周血Th1细胞均明显高于正常对照组(P 均 ＜0.01，表 1、图 2)，高活动性 AS 组明显高于低活动性AS组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

图1 流式细胞术检测CD3+CD8-CD69+细胞(CD69细胞)设门分析方法Fig.1 CD3+CD8-CD69+cells detected by flow cytometry

图2 Th1细胞所占的百分数Fig.2 The percent of Th1 cells(%)

图3 Th2细胞所占的百分数(%)Fig.3 The percent of Th2 cells(%)

图4 Treg细胞所占的百分数(%)Fig.4 The percent of Treg cells(%)

2.2 外周血Th1、Th2、Treg细胞与AS活动性的相关性

AS患者外周血Th1细胞比例与Bath强直性脊柱炎病情活动指数(BASDI)呈正相关，Th2细胞和Treg细胞与BASDI均呈负相关。见表2。

表2 AS患者外周血Th1、Th2、Treg细胞与BASDI的相关性分析Tab.2 The analysis for correlation of Th1，Th2 and Treg cells in peripheral blood of AS patients with BASDI

3 讨论

AS被认为与遗传、环境，感染相关一种严重的慢性炎性风湿性疾病[7]。目前发现在AS这类自身免疫性疾病的发病机制中，免疫功能紊乱起重要作用，如 B淋巴细胞亚群[8]、CD4+T淋巴细胞异常[9]。初始 CD4+T 细胞，在 IFN-γ、IL-2 等细胞因子的诱导下，分化为Th1细胞，在IL-4等细胞因子的诱导下分化为Th2细胞，在TGF-β、IL-10等细胞因子的诱导下分化为Treg细胞[10]。

Th1 细胞分泌 IFN-γ、IL-2、TNF-β 等细胞因子，主要参与介导细胞免疫应答、细胞毒性T细胞和巨噬细胞活化，以及迟发型超敏反应，增强其抗感染能力，同时可抑制过度的Th2细胞介导的免疫反应。本研究结果显示，AS患者Th1细胞增高，符合与Nurieva等[11]对AS患者Th1、Th2细胞的研究结果。本研究还发现，患者外周血Th1细胞与BASDI(即AS活动性)呈明显正相关。低活动性AS组(也就是AS早期)，就出现Th1细胞数量的异常增高，且伴随AS活动性的增高，Th1细胞异常增高的程度更为显著。由此可见，AS是一类由Th1细胞亚群驱动的疾病，且与疾病活动性高度相关。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-6等细胞因子，主要参与抗体介导的免疫应答、B细胞和嗜酸性粒细胞活化以及 IgE的生成，Th2细胞分泌的IL-4是重要的抑制炎症因子，在体内发挥抗炎作用，调节Ig类别的转化。本研究结果显示，AS患者Th2细胞与AS活动性呈负相关，且在AS患者外周血中，表现为细胞百分含量的降低。低活动性AS组外周血Th2细胞稍降低，但与对照正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05);伴随着AS患者病情的进展，导致高活动性AS组Th2细胞明显低于正常对照组(P＜0.01)。提示在AS早期，在AS患者自身免疫系统中，Th2细胞抑制炎症作用并不不明显，而AS晚期，Th1细胞的增高，可能导致了Th2细胞的大幅度降低，Th1和Th2产生的细胞因子间，存在交叉调节作用。由Th1细胞分泌的IFN-γ可抑制Th2细胞分化增殖。本研究在CD4+Th细胞亚群中，Th1细胞介导的炎症反应在AS患者中为主导，Th1细胞的明显增多导致Th2细胞负调节作用减弱，产生了过多的炎性细胞因子，致使抗炎介质的缺乏，Th1激活程度低下，Th2激活程度增强，最终导致Th1/Th2失衡。并且这种失衡是一种渐进的趋势。

Treg细胞根据来源分为天然 Treg细胞(nT-regs)和诱导性 Treg细胞(iTregs)，nTregs由胸腺细胞自然分化发育而来，iTregs由外周成熟的CD4+CD25-T淋巴细胞受到特异性抗原刺激并在细胞因子的诱导下转化而来，具自身特异性，免疫负性调节功能[12]，外周的 iTregs 通过分泌 IL-10、TGF-β等具抑制性的细胞因子，抑制Thl细胞产生细胞因子及其活性，调控免疫应答的强度，减轻对机体组织损伤作用[13-14]，AS疾病中有关Treg细胞的研究存在上、下调结论的不一致性，王朋等[15]对AS患者Treg细胞检测结果呈上调与Crispin等关于自身免疫性疾病外周血Treg细胞表达水平下降的结论恰好相反[16]。本研究结果显示，AS患者外周血Treg细胞低于健康对照组，支持Crispin等的结论。本研究小组所得结果显示，AS患者体内存在Th1、Th2、Treg数量的失衡。Th2细胞和Treg细胞数量减少，Th1细胞增加，破坏了免疫系统的稳态，从而引起免疫应答异常[17]。故在 AS的治疗中，纠正Th1、Th2、Treg细胞量的失衡、调节其数量和功能状态可能是治疗AS的有效方法。

综上所述，本研究表明，AS患者存在 Th1、Th2、Treg细胞的失衡。伴随着AS疾病活动度的增高，由Th1细胞介导的细胞免疫功能在患者体内表达亢进，而Th2细胞和Treg细胞介导的免疫抑制作用减弱。联合检测AS患者外周血Th1、Th2、Treg细胞，对AS发病机制研究、病情变化以及治疗监测可能会成为较好的检测项目，可能为AS诊疗提供新思路。

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