富硒板党对D-半乳糖所致衰老小鼠模型的影响

詹光杰 杨年安(湖北民族学院医学院，湖北 恩施 445000)

富硒板党(BCPA)因出产于有“中国硒都”之称的湖北恩施板桥境内而得名。1981年在全国药材品种质量鉴定会上定名为“中国板党”，简称“板党”。BCPA富含多种甾醇、多糖、皂甙、多种氨基酸和微量元素，有清除体内活性氧，减少丙二醛(MDA)产生，提高超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力等药理作用〔1，2〕。本研究采用D-半乳糖诱导致亚急性衰老小鼠模型，分别注射不同剂量BCPA注射液，观察BCPA对衰老小鼠学习记忆的影响，并从氧化应激方面探讨BCPA抗衰老作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种小鼠(雌雄各半)，5～7周龄，体重(22.3±3.2)g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，常规饲养。

1.2 药品与仪器 D-半乳糖(Sigma公司)，IL-2、IL-6 ELISA试剂盒(晶美公司)，MDA、LP、GSH-Px、SOD 及羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物制品研究所)，其他化学试剂为国产分析纯试剂(湖北恩施乐之塬科技公司)。FA1640电子天平(上海天平仪器厂)，电动玻璃匀浆机(宁波新芝科技股份有限公司)，全自动酶标仪(美国 Thermo公司)，紫外分光光度仪(美国Beckman公司)，DMS-2 Morris水迷宫系统(中国医学科学院药物研究所)。

1.3 BCPA注射液 购自恩施板桥乡中药材生产质量管理规范(GAP)示范基地，采用水提醇沉法制成含生药30%(相当于生药含量2 g/ml)的液体，瓶装密封消毒贮存于4℃备用，用时以生理盐水稀释成0.4 g/ml。

1.4 动物分组、造模及给药 将昆明种小鼠(雌雄各半)40只，随机分为正常组、模型组、高剂量组、中剂量组及低剂量组，每组8只。模型组、高剂量组、中剂量组及低剂量组每天按500 mg/kg腹腔注射D-半乳糖〔3〕，正常组腹腔注射相等量生理盐水。高剂量组、中剂量组及低剂量组在注射D-半乳糖的同时每天腹腔按7.2、3.6及1.8 g/kg注射BCPA，模型组、正常组注射等量生理盐水。各组自由进食、饮水，常规饲养连续50 d。

1.5 Morris水迷宫实验 从造模给药第40天起，参照Morris水迷宫实验方法测量小鼠学习和记忆能力〔4，5〕。每天注射后进行训练，上下午各1次，历时10 d。水迷宫为通用型，圆形桶，直径180 cm、高50 cm，水池内壁涂为黑色，水深30 cm，水温控制在22℃ ～24℃。在水池壁边沿平均分为四个不同的标记，把水池分为一、二、三、四个象限，选第三象限正中放置高度为28 cm，直径8 cm的平台，没入水下2 cm。将小鼠面向池壁，依次由第一、二、三、四象限入水点放入水中，记录120 s内找到平台的时间(逃避潜伏期)，如120 s内未能找到平台，由实验者将其引至上面停留10 s，再放回笼中，逃避潜伏期记为120 s。第9天最后1次训练后撤除水下平台，第10天在同一入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠在120 s内跨越原平台相应位置的次数，以衡量小鼠对水迷宫记忆的获取能力。

1.6 小鼠皮肤羟脯氨酸及脑组织MDA、脂褐质(LP)、SOD及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的检测 水迷宫训练结束后，分别取各组小鼠背部皮肤约1 cm2，去毛及脂肪，用1∶1丙酮-乙醚脱脂，切碎晾干，精密称取30 mg，按试剂盒说明书进行羟脯氨酸含量的测定。然后处死小鼠，取小鼠脑组织放入冰冻生理盐水(0.9%)冲洗拭干，迅速用精密分析天平称取重量后剪碎，制备成10%匀浆，离心后取上清。按照试剂盒说明书分别进行组织MDA、LP、SOD及GSH-Px的检测，并用紫外分光光度计测定出结果。

1.7 ELISA法检测BCPA对小鼠血清中白细胞介素(IL)-2及IL-6的影响 小心收集小鼠血清于无内毒素、热原的试管中，及时处理或贮存在－70℃冰箱。检测采用双抗体夹心酶联免疫吸附(ELISA)法，具体步骤参考试剂盒说明书。

2 结果

2.1 BCPA对D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空间探索的影响 模型组小鼠找到平台的潜伏期长。BCPA各组潜伏期与模型组相比较均有明显减少(P＜0.05)。在空间探索实验中，模型组小鼠穿越平台的次数比其他各组小鼠的次数少(P＜0.05)。见表1。

2.2 BCPA对D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织匀浆的抗氧化作用 对照组及BCPA各组组织匀浆MDA与LP含量均低于模型组(P＜0.05)。对照组及BCPA各组组织匀浆中SOD与GSH-Px的活性明显高于模型组(P＜0.05)。高剂量与低剂量BCPA组的MDA与LP含量要低于低剂量BCPA组，而其SOD与GSH-Px活性高于低剂量BCPA组(P＜0.05)。见表2。

2.4 BCPA对D-半乳糖所致衰老小鼠皮肤羟脯氨酸含量的影响 模型组、BCPA低、中、高剂量组小鼠皮肤羟脯氨酸含量分别为(7.48±2.67)、(9.83±1.34)、(10.27±1.52)、(11.54±2.35)μg/ml，注射D-半乳糖各组小鼠皮肤羟脯氨酸含量都明显低于对照组〔(14.32±2.85)μg/ml，P ＜0.05〕，然而 BCPA 各组小鼠皮肤中羟脯氨酸的含量明显高于模型组(P＜0.05)。

2.3 BCPA对D-半乳糖所致衰老小鼠各组血清中IL-2、IL-6含量的影响 见表2。各BCPA组小鼠血清中IL-2、IL-6含量显著高于对照组和模型组(P＜0.05)，模型组小鼠血清中IL-2、IL-6比对照组要低(P＜0.05)。

表1 BCPA对D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空间探索的影响(±s，n=8)

表1 BCPA对D-半乳糖所致衰老小鼠定位航行和空间探索的影响(±s，n=8)

与模型组比较:1)P＜0.05

组别 平均潜伏期(s) 穿越原平台次数(次)BCPA低剂量组 54.65±11.1211) 3.87±1.2411)BCPA中剂量组 52.32±10.4511) 4.12±1.4311)BCPA高剂量组 50.12±9.8711) 4.36±1.0811)模型组 81.27±20.341.24±0.65对照组 46.76±11.351) 4.58±1.531)

表2 BCPA对D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织匀浆的抗氧化性作用及对小鼠血清IL-2、IL-6含量的影响(±s，n=8)

表2 BCPA对D-半乳糖所致衰老小鼠脑组织匀浆的抗氧化性作用及对小鼠血清IL-2、IL-6含量的影响(±s，n=8)

与模型组比较:1)P＜0.05，与BCPA低剂量组比较:2)P＜0.05

组别SOD(U/mg)MDA(mol/mg)LP(μg/mg)GSH-Px(U/g)IL-2(pg/ml)IL-6(ng/L)BCPA低剂量组 155.36±10.4211) 9.36±0.5211) 65.42±1.8811) 67.31±1.6511) 90.13±4.091) 123.16±3.671)BCPA中剂量组 187.34±8.3121)2) 8.57±0.9121)2) 58.51±1.3421)2) 70.35±3.1821)2) 105.34±4.251) 142.08±3.531)2)BCPA高剂量组 195.21±9.1421)2) 7.24±0.8421)2) 51.57±1.5821)2) 75.42±2.8321)2) 118.65±4.571)2) 164.23±3.451)2)模型组 121.47±9.7613.67±1.5677.32±1.7655.13±3.2532.78±2.952) 53.87±2.742)对照组 184.28±7.5811) 9.04±0.4511) 57.62±2.4511) 64.57±4.4711) 57.82±3.241)2) 96.54±3.081)2)

3 讨论

本实验是采用连续注射D-半乳糖在小鼠体内积累，使细胞内醛糖还原酶将其还原成不能正常代谢的半乳糖醇，而半乳糖醇一旦在体内堆积就会影响细胞的渗透压，导致细胞肿胀、细胞功能障碍、代谢紊乱而致使机体衰老〔6〕。衰老是一种复杂的生命现象，机体在发育成熟后，体内各种生理功能进行性下降的过程。有关衰老的机制，科学家提出了多种假说，自由基学说就是其中之一。该学说主要观点认为衰老是生命过程中代谢所产生的活性氧造成的损伤累积而引起的，抗氧化转基因动物实验证明了这一理论，过量表达SOD和过氧化氢酶的转基因果蝇寿命得以延长〔7〕。过多的氧自由基会造成细胞膜的破坏，使蛋白质(酶)变性，并会导致一系列神经功能损伤，造成认知障碍，加速衰老。

衰老早期的认知受损主要表现在学习能力的下降及记忆障碍。本研究结果提示小鼠的空间定位能力、空间记忆能力等认知能力均出现了一定程度的损伤，BCPA对衰老过程中的认知障碍有较好的恢复作用。SOD在有机体内平衡氧化与抗氧化，清除超氧离子自由基，保护细胞;MDA则是通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，破坏生物膜中的不饱合脂肪酸，形成脂质过氧化物，导致细胞损伤;LP在细胞中的堆积会引起细胞免疫能力的下降，细胞功能受损，诱发衰老，如果在脑细胞中堆积则会引发学习记忆等认识障碍;GSH-Px可特异性还原GSH对过氧化氢的还原，清除有害过氧化物代谢产物，切断脂质过氧化，保护细胞正常生理功能。本实验提示不同剂量BCPA对D-半乳糖所致衰老模型小鼠的作用效果是不同的，本研究推测与BCPA注液中有效成分的含量有关。

羟脯氨酸本是胶原蛋白的组成成分，在机体衰老过程中，会因氧气供给不足而影响脯氨酸的羟化作用，致使皮肤中羟脯氨酸的含量下降。本实验结果表明，BCPA可以有效地恢复衰老小鼠皮肤中的羟脯氨酸的含量。

IL-2可维持细胞的增殖，刺激T细胞转铁蛋白受体、胰岛素受体等抗原表达，诱导多种杀伤细胞的分化和效应功能。IL-6与IL-6受体结合后，在机体内有多种生物学活性，如可影响细胞生长，促进细胞分化等。在本实验中BCPA能显著增加小鼠体内的IL-2和IL-6的含量，提示BCPA能有效地增强衰老小鼠的免疫功能，有助于促进细胞的分裂增殖。

本研究结果表明BCPA的有效成分具有多种生物学活性，可以通过不同的通路发挥抗衰老作用，在改善学习记忆功能，清除体内自由基抗氧化，增强机体免疫能力等方面都有较好的作用，但BCPA抗衰老机制还有待于从分子水平进行研究。

1 肖本见，陈国栋，兰宗平.富硒板党地上部分对小鼠益智和低氧/复氧损伤的保护作用的研究〔J〕.中药材，2005;28(8):688-90.

2 郭 美，刘丽莎，何 敏，等.党参抗衰老作用的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(5):1205-7.

3 姜国良，于 晓，徐 恺，等.腹腔和皮下注射D-半乳糖衰老大鼠模型分析〔J〕.中国老年学杂志，2013;33(5):1101-3.

4 王绪平，呙登俊，陈 宇，等.Morris水迷宫实验评价血管性痴呆大鼠模型的学习记忆能力〔J〕.中华中医药学刊，2013;31(1):99-100.

5 刘金凤，聂 坤，栗振杰，等.Morris水迷宫测评方法的改进及对快速老化痴呆小鼠SAMP8认知功能的再评价〔J〕.中国中医急症，2013;22(1):5-7.

6 Song X，Bao M，Li D.Advanced glycation in D-galactose induced mouseaging model〔J〕.Mech Ageing Dev，1999;108(3):239-51.

7 李 燕.银耳多糖的抗衰老作用及其机制研究〔D〕.上海:第二军医大学，2004.