重组pcDNA3.1-HEGF基因真核表达载体的构建

李 伟 胡红梅 陈彩芬 黄玉珊 (井冈山大学临床医学院口腔系，江西 吉安 343000)

牙的缺失与损坏是常见疾病，目前治疗措施有限，且都不能达到生理学的修复目的。2000年，Couble等〔1〕成功体外培养牙髓细胞，而且证实了牙髓中存在能够分化成成牙本质细胞的干细胞-牙髓干细胞，牙髓干细胞的发现将为牙体的再生研究提供新的思路。人表皮生长因子(HEGF)由53个氨基酸组成，是存在机体内的一种细胞因子，是一种强有力的细胞分裂促进因子，有着广泛的生理功能。有学者发现HEGF能促进大鼠牙髓干细胞的DNA合成和抑制大鼠牙髓干细胞的碱性磷酸酶的活性〔2〕。本研究利用基因工程技术克隆HEGF结构基因，并进行构建HEGF基因真核表达载体的研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料 pfu高温DNA聚合酶(北京百川开泰公司)，Taq PCR Master Mix(上海生工)，限制性内切酶 HindⅢ，BamHⅠ，dNTP ，T4 DNAligase Buffer，T4 DNAligase(Promega公司)，DH5α感受态细胞(上海生工)，克隆载体pcDNA3.1+，载体抗性 Ampicillin，载体长度 5.4 kb(上海生工)，geneRuler SM0331 marker(MBI公司)，引物设计:oiniga基因分析软件，参照Pubmed上公布的HEGF基因序列进行分析后设计引物，引物由上海生工公司合成，

1.2 主要仪器 全温度振荡培养箱FZQ-F100(江苏太仓华美仪器公司)，超低温冰箱MDF-U53(日本三洋)，电热恒温鼓风干燥箱 SKFG-1(上海玺恒)，凝胶成像分析系统 Bioseep Flexi1000(日本奥林巴斯)，紫外-可见分光光度计(北京普析通用)，酶标仪BIO-RAD(美国伯乐)，电子天平BSA-124S(德国SARTORIUS)，高压灭菌锅LX-B75-IL(北京华泰)，超净工作台SW-G-2FD(苏州净化)。

1.3 目的片段的扩增 参考Pubmed，HEGF的基因序列长度为183 bp，HEGF为8条引物，通过PCR扩增出足够量的目的产物，PCR反应采用的是pfu高温聚合酶。PCR各个成分的用量:(引物浓度为1 OD溶于400 μl ddH2O)，HEGF反应体系:50 μl，引物 Mix(0.4×引物条数)3 μl，dNTP1 μl(25 mmol/L)，10× Pfu Buffer 5 μl，Pfu 0.4 μl(5 U/μl)，ddH2O 41 μl，引物 Mix为每条引物5 μl的混合液。PCR程序:95℃预变性3 min，94℃变性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 60 s，最后延伸 6 min，22 个反应循环。然后以PCR产物为模板，基因的首尾引物作为上下游引物，进行第二次扩增，PCR各个成分的用量:(引物浓度为1 OD 溶于 400 μl ddH2O)，反应体系:50 μl，第一轮 PCR 产物 2 μl，HEGF P1 2 μl，HEGF P8 2 μl，dNTP 1 μl(25 mmol/L)，10×Pfu Buffer 5 μl，Pfu 0.4 μl(5 U/μl)，ddH2O 38 μl。PCR 程序:95℃预变性 3 min，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸60 s，最后延伸6 min，22个反应循环。

1.4 PCR产物与载体pcDNA3.1+酶切回收 在HEGF基因PCR扩增以后，进行酶切回收实验，首先在20 μl的PCR产物中加入其两倍体积的Binding Buffer，然后转入2 ml带柱子的收集管中，13 000 r/min，离心，弃去收集管中滤液。加Binding Buffer 300 μl，13 000 r/min，离心，弃去收集管中滤液，此时DNA 已经挂在柱子上。加 Wash Solution 700 μl，13 000 r/min，离心，弃去收集管中滤液。重复上述步骤，把DNA以外的杂质洗脱完毕，将柱子装入 1.5 μl的 EP 管中，加 50 μl，60℃的水洗脱 DNA，13 000 r/min，离心。酶切体系:50 μl，HEGF PCR 产物酶切体系:HEGF PCR 产物 20 μl，BamHI 1 μl(10 U/μl)，HindⅢ 1 μl(10 U/μl)，10×Buffer BamH Ⅰ 5 μl，ddH2O 23 μl，以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应3 h。载体的酶切体系:pcDNA3.1+1.5 μg，BamHⅠ1 μl(10 U/μl)，HindⅢ 1 μl(10 U/μl)，10× Buffer BamHⅠ10 μl，ddH2O 补足至50 μl，以上体系放入37℃恒温水浴锅中反应3 h，将所需目的片段切胶回收备用。

1.5 目的片段与载体连接 酶切回收结束后，接下来将回收纯化好的目的DNA片段和载体进行连接，连接体系:20 μl，酶切目的片段8 μl(50 ng)，酶切载体5 μl(100 ng)，10× T4，DNA-ligase Buffer 2 μl，T4 DNAligase 1 μl(5 U/μl)，ddH2O 补充至20 μl，上述连接混合液16℃水浴2 h即可。

1.6 转化、筛选克隆 本次质粒构建实验的关键步骤是要转化，即将载体DNA导入感受态细菌中，从而得到含有目的DNA插入的转化菌株，通过分析文献及咨询专家，最终选择的感受态细菌是大肠杆菌株(DH5α)，取一试管感受态细菌DH5α置于冰上进行融化，溶化后取100 μl的菌液。将上述连接液转入DH5α菌液中，轻轻摇动试管以便混匀混合物 HEGF，冰浴30 min，然后42℃中水浴90 s，冰浴3 min，此过程切勿摇动试管，向离心管中加入500 μl的LB液体培养基，混匀后37℃置于摇床上45 min，取已经转化的感受态细菌DH5α置于LB固定培养基，检测筛选出阳性克隆进行测序。

2 结果

2.1 PCR产物纯化结果按照Pubmed上的HEGF目的片段的相关信息，经过两轮PCR扩增出HEGF目的片段的基因片段，PCR产物经1.9%琼脂糖凝胶电泳，纯化，长度为183 bp。实验所用的Marker是MBI公司的SM0331(图1)，HEGF目的片段序列测序资料见图2。

图1 HEGF PCR产物纯化(长度为183 bp)及MBI公司的SM0331 Marker

图2 HEGF的基因序列测序图谱

2.2 PCR产物与载体pcDNA3.1+酶切结果通过PCR产物与载体pcDNA3.1+酶切结果来看，PCR扩增出HEGF目的片段长度为183 bp，pcDNA3.1+酶切后的长度为5.4 bp，长度符合要求，酶切电泳图见图3，图4。

图3 HEGF酶切电泳图

图4 PCDNA3.1+酶切电泳图

2.3 HEGF基因真核表达载体的构建的酶切图 重组质粒pcDNA3.1+HEGF提取纯化后的酶切图谱显示，pcDNA3.1的长度为5.4 bp，HEGF的长度为183 bp，已经成功构建了质粒，见图5。

图5 成功构建的pCDNA3.1+HEGF质粒酶切图

3 讨论

牙齿是高度矿化的器官，是由于来源于外胚层的口腔上皮和底层的颅神经嵴来源的间充质细胞之间的相互作用的结果，牙再生医学是利用生物技术完全再生出牙齿或牙齿局部组织再生，然而牙齿发育和萌出机制过于复杂，涉及牙髓干细胞、成牙本质细胞、牙周膜细胞等多种细胞，尤其牙齿形成的关键细胞-牙髓干细胞的分化机制并不十分清楚因此，对牙髓干细胞等种子细胞进行基因修饰，促使其定向分化为牙齿组织甚至组织工程牙齿，就具有重要的意义。HEGF基因位于染色体4q25-27，mRNA约为4.75 kb，编码含1 217个氨基酸前体，目前的研究发现其可促进组织的愈合并可使小鼠牙齿早萌，刘俊等〔3〕发现大鼠表皮生长因子可以促进体外培养的人牙髓干细胞的增殖，大鼠表皮生长因子有效作用浓度越大，牙髓干细胞生长密度越大。由于目前HEGF与真核表达HEGF及生物活性的差别，促使学者将HEGF基因导入真核表达载体，采用基因转移技术将其导入干细胞中，并获得HEGF表达蛋白，使其持续分泌表达表皮生长因子，以促进干细胞的增殖和分化〔4〕。基因工程重组技术中能够将目的基因转移至受体细胞的载体也影响着基因工程的研究进展，其中包括细菌质粒、噬菌体和动植物病毒，pcDNA3.1+是一种真核表达载体，属于构建基因疫苗的载体，在哺乳动物表达载体能使重组质粒获得高水平表达的重组蛋白，能使外源基因在哺乳动物细胞中获得瞬时或稳定的表达，它带有的Zeocin选择标记比 G418经济快捷，增强子-启动子序列为CMV，可获得高水平的表达。目前用pcDNA3.1结合各种基因构建质粒影响神经干细胞、骨髓基质干细胞和软骨细胞的研究都取得成功，对各种干细胞的增殖和分化都取得较好的作用〔5，6〕，但用pcDNA3.1来结合HEGF对牙髓干细胞的研究尚未见报道。

本次实验为了牙髓干细胞的增殖和分化的后续研究，成功构建了pcDNA3.1-HEGF真核表达质粒。并经过测序分析，证实成功获得pcDNA3.1+HEGF质粒，本课题组将在随后的研究中，对DPSC的增殖和分化进一步研究，为牙齿的再生研究奠定良好的实验基础。

1 Couble ML，Farges JC，Bleicher F，et al．Odontoblast differentiatlon of human dental pulp cells in explant cultures〔J〕．J Calcif Tissue Int，2000;66(2):129-38．

2 Liang RF.Effect of transforming growth factor-β epidermal growth factor on clonal rat pulp cells〔J〕．Arch Oral Biol，1990;35(1):7-11．

3 刘 俊，李玉晶，张海燕，等.表皮生长因子对人牙髓细胞DNA合成及细胞周期的影响〔J〕．现代口腔医学杂志〔J〕．2003;17(3):200-2．

4 范青源，戴方平，应 康，等.人表皮生长因子基因体外转染人角质形成细胞的研究〔J〕．中华皮肤科杂志，2002;33(1):48-50．

5 徐 强，徐如祥，姜晓丹，等.重组质粒pcDNA311his-hTH与pEGFPC2共转染骨髓基质细胞源神经干细胞的实验研究〔J〕．中华神经外科，2005;21(2):118-22．

6 薛 震，吕松岑，赵金东，等.重组pcDNA3-1-hBMP-7真核表达载体的构建及转染兔骨髓基质干细胞的实验研究〔J〕．中国矫形外科，2007;15(20):1570-3．