山楂叶总黄酮对血管性痴呆大鼠学习记忆的干预作用及机制

吴晓光 李 玲 苗光新 赵淑敏 檀荣方 曹 慧

(承德医学院基础医学研究所，河北 承德 067000)

慢性脑供血不足是引起血管性痴呆(VD)最常见的原因之一。脑组织缺血缺氧可引起神经细胞变性、坏死、凋亡及胶质细胞肿胀增生。乙酰胆碱(Ach)是与学习记忆最为密切相关的神经递质〔1〕，海马组织内Ach含量持续性减少是VD发生、发展的主要原因〔2〕。山楂叶总黄酮(TFHL)是从山楂树叶中提取分离的黄酮化合物〔3〕，主要成分为芦丁、牡荆素、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素鼠李糖苷、槲皮素和金丝桃苷等〔4〕。TFHL制剂(益心酮)具有降血压、降血脂、强心、抗心肌缺血〔5〕、提高脑组织抗氧化〔6，7〕等多方面的作用，在心血管疾病方面疗效肯定，临床已得到广泛应用，但其对VD的学习记忆障碍是否具有保护作用尚不清楚。本研究观察TFHL对VD模型大鼠学习记忆能力、神经元形态密度、神经胶质酸性蛋白(GFAP)的表达及海马组织内乙酰胆碱酯酶(AChE)和乙酰胆碱转移酶(ChAT)活性的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 成年雄性清洁级SD大鼠，60只，体质量(260±20)g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号:scxk(京)2006-2009。饲养于承德医学院二级实验动物中心，室温维持在18～24℃，相对湿度(40～60)%，自然光照，自由进食进水。适应1 w，大鼠随机分为假手术组、模型组、TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ组，每组12 只。

1.2 药物 TFHL购于山西振东泰盛制药有限公司，纯度98%。用前蒸馏水溶解，浓度为10 mg/ml。

1.3 试剂与仪器 GFAP抗体、3，3-二氨基苯联胺(DAB)试剂盒，SABC免疫组化试剂盒(博士德生物科技有限公司)，AChE、ChAT试剂盒(南京建成生物工程有限公司)，Morris水迷宫视频分析系统(中国医学科学院药物研究所)，分光光度计(上海京工实业有限公司)。

1.4 模型制备及给药 模型组、TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ组制备VD模型:30 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颈部正中矢状切口，钝性分离皮下组织及筋膜，在颈动脉三角处游离出双侧颈总动脉，结扎并切断双侧颈总动脉，缝合切口，术后24 h内未苏醒者剔除，并及时补遗。假手术组除不结扎双侧颈总动脉外，其余操作同其他各组。大鼠苏醒后，每只注射1次青霉素预防感染。术后第 14天，TFHLⅠ、Ⅱ、Ⅲ组分别给 TFHL 70、140、280 mg·kg－1·d－1灌胃，连续36 d。假手术组及模型组给予等体积生理盐水。

1.5 Morris水迷宫实验 定位航行实验:在造模前第4天将大鼠依次放入Morris水迷宫进行适应性游泳训练1次，共计60 s，不放平台，不记录成绩。在造模前第3天和第2天，将平台放入任一象限中央，进行定位航行实验，用于检测大鼠间是否存在学习记忆障碍:将大鼠从A、B、C、D 4个入水点面向池壁依次放入水中，观察在60 s内大鼠找到并爬上平台所用的时间(逃避潜伏期)，若60 s内未能找到平台，则将其引导到平台并在平台上停留15 s，潜伏期记为60 s。给药第30天，再将大鼠依次放入Morris水迷宫进行适应性游泳训练1次，共计60 s，不放平台，不记录成绩。给药第31天，开始进行定位航行实验，用于检测大鼠对空间记忆的获得能力，每天1次，共6 d。

空间探索实验:用于检测大鼠对平台区域的准确记忆能力，第6天，定位航行实验结束后，撤去平台，由第Ⅱ象限入水点面向池壁放入大鼠，观察大鼠在60 s内穿越平台区域的次数及平台象限游泳路程百分比。

1.6 病理学及免疫组化检测 行为学实验结束后，每组随机选取6只，30 mg·kg-1戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛左心室插管灌注固定，取脑组织常规石蜡包埋，5 μm连续冠状切片，每隔3片选取1张切片。常规HE染色，光镜观察海马神经元形态及密度，并用MiVnt病理图形分析系统计算神经元密度及细胞脱失率。免疫组化法检测GFAP的表达，具体步骤按试剂盒说明书进行，光镜下观察GFAP的表达情况，利用MiVnt病理图形分析系统进行图像分析。

1.7 海马组织AChE、ChAT活性检测 行为学实验结束后，将每组余下的6只大鼠在冰台上断头取脑，分离出海马组织，4℃生理盐水冲洗残留血液，分析天平称重，加入9倍体积的预冷生理盐水，组织匀浆器匀浆，按试剂盒说明书测定AChE、ChAT活性。

1.8 统计学方法 应用SPSS17.0软件行one-wayANOVA方差分析，方差齐用LDS检验，方差不齐用Games-Howell检验。

2 结果

2.1 各组大鼠定位航行能力的变化 各组大鼠逃避潜伏期及寻找平台游泳路程无显著差异(P＞0.05)。术后大鼠定位航行实验结果显示:与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期延长，寻找平台游泳路程明显延长(P＜0.01);TFHL各组药物干预后，TFHLⅠ组大鼠的逃避潜伏期及寻找平台游泳路程已明显缩短(P＜0.05)TFHLⅡ、Ⅲ组优于Ⅰ组(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ组之间无显著性差异(P＞0.05)，见图1，表1。

2.2 各组大鼠空间探索能力的变化 模型组的大鼠在60s内穿越平台区次数减少，与假手术组比较平台象限游泳路程百分比明显降低(P＜0.01);TFHL各组药物干预后，TFHLⅠ组大鼠穿越平台区次数增多，平台象限游泳路程百分比显著增加(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ组优于Ⅰ组(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ组之间无显著性差异(P＞0.05)，见图2，表1。

2.3 各组大鼠海马CA1区神经元形态及密度的变化 HE染色显示，假手术组海马CA1区神经元排列整齐，可见3～4层细胞，染色均匀，细胞核大而圆，染色浅，核仁清晰;模型组大部分神经元变性坏死，排列紊乱，细胞周围间隙加大，细胞核浓缩、深染、溶解、消失，细胞胞质结构不清，神经元密度显著降低;与模型组比较，TFHL各组病变明显减轻，正常神经元数量明显增多，排列稍规则，结构较清晰，神经元密度显著增多(P＜0.05，P＜0.01)，TFHLⅡ、Ⅲ组优于Ⅰ组(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ组之间无显著差异(P＞0.05)，见表1。

图1 各组大鼠定位航行能力的变化

图2 各组大鼠空间探索能力的变化

表1 各组大鼠定位航行能力、空间探索能力、CA1区神经元密度及神经元脱失率的比较(±s，n=12)

表1 各组大鼠定位航行能力、空间探索能力、CA1区神经元密度及神经元脱失率的比较(±s，n=12)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与模型组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.01，下表同

组别 逃避潜伏期(s)游泳距离(m) 穿越平台次数 平台象限游泳距离百分比神经元密度(mm2)神经元脱失率(%)0.5376.43±9.260模型组 19.54±6.121) 3.6502±0.62311) 3.96±1.341) 33.42±5.321) 38.74±8.351) 48.47±6.121)TFHL Ⅰ组 13.43±2.792) 2.3912±0.46822) 5.92±1.982) 43.68±6.142) 46.62±5.482) 17.64±4.382)TFHL Ⅱ组 10.01±2.853) 2.0044±0.32193) 6.17±2.123) 48.22±7.393) 54.93±2.632) 14.67±3.803)TFHL Ⅲ组 9.14±2.943) 1.8302±0.39683) 7.22±2.233) 49.56±7.463) 56.26±6.232) 14.32±3.563)假手术组 5.86±2.431.1302±0.3614 12.40±4.2669.43±1

图3 各组大鼠脑组织GFAP表达的变化(DAB，×400)

2.4 各组大鼠脑组织GFAP的表达变化 免疫组化染色显示:假手术组星形胶质细胞GFAP表达弱阳性，位于胞质内，细胞阳性突起较小;模型组表达数量增多，胞体肿胀，突起增粗，呈强阳性;TFHL各组药物干预后，GFAP表达明显减少，胞体肿胀减轻(P＜0.05，P＜0.01)，TFHLⅡ、Ⅲ组优于Ⅰ组(P ＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ组之间无显著差异(P＞0.05)，见图3，表2。

2.5 各组大鼠海马AchE、ChAT活性的变化 分光光度比色法显示:模型组大鼠海马组织内AchE活性升高，ChAT活性降低，与假手术组比较有极显著差异(P＜0.01);TFHL各组药物干预后，AchE活性降低，ChAT活性升高，与模型组比较有显著差异(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ组优于Ⅰ组(P＜0.05)，TFHLⅡ、Ⅲ组之间无显著差异(P＞0.05)，见表2。

表2 各组大鼠脑组织GFAP表达、ChAT、AchE活性变化的比较(±s，n=6)

表2 各组大鼠脑组织GFAP表达、ChAT、AchE活性变化的比较(±s，n=6)

0.14±0.08226.83±39.760.66±0.17模型组 3.46±0.891) 119.84±46.521) 1.32±0.351)TFHL Ⅰ组 1.56±0.562) 155.34±39.612) 0.94±0.282)TFHL Ⅱ组 1.07±0.263) 179.63±38.263) 0.84±0.193)TFHL Ⅲ组 0.93±0.173) 186.53±37.793) 0.82±0.233)GFAP ChAT AchE假手术组组别

3 讨论

VD主要表现为记忆、认知功能缺损，严重影响着患者的身心健康。海马是参与学习记忆功能的主要脑区，与海马胆碱能系统密切相关〔8〕。海马血供单一，少有侧支循环，对缺血缺氧极为敏感。有证据表明，缺血导致海马CA1区神经元脱失是VD的主要病理基础〔9〕。本文结果显示:TFHL各组药物干预后，海马CA1区神经元形态恢复正常，密度增加，学习记忆能力明显提高，说明TFHL可保护神经元、减少海马CA1区神经元脱失，改善VD大鼠学习记忆障碍。

星形胶质细胞是脑组织中数量庞大的一组非神经元细胞，对神经元起支持、保护、营养作用。GFAP是星形胶质细胞特异性标志蛋白，其表达量的多少可以反映星形胶质细胞的功能状态。国内外研究发现，炎症反应在VD的发生与发展中起到一定的作用〔10〕。VD病脑内存在异常激活的星形胶质细胞，这些被激活的星形胶细胞释放一些毒性因子参与了VD的发病过程，抑制星形胶质细胞活化，可减轻VD大鼠的学习记忆能力〔11〕。本实验结果显示:TFHL各组海马组织内星形胶质细胞GFAP表达明显减少，胞体肿胀减轻，说明TFHL药物对脑缺血的保护作用机制可能与其抑制脑缺血后GFAP过度活化，减少星形胶质细胞释放炎症因子有关。

Ach是中枢胆碱能神经系统重要的神经递质，在脑组织内广泛分布，与学习记忆功能密切相关。ChAT是合成Ach的关键酶，主要存在于胆碱能神经元内，在胞体内合成，通过轴突运输到神经末梢的胞质中，是衡量Ach能神经元功能的主要标志〔12〕。AChE的作用是分解 Ach，与 ChAT共同调节 Ach的动态平衡。研究发现VD患者脑组织内乙酰胆碱含量减少，ChAT的活性降低，胆碱能神经的信息传递中断，造成动物获得性记忆障碍〔13〕。另有实验表明大鼠脑缺血后，VD含量降低，给予拟胆碱能药物能增强ChAT的活性，增加脑组织内VD含量，改善大鼠的学习记忆功能〔14〕。本研究结果说明TFHL可通过降低海马神经元AChE活性、增强ChAT活性来增加脑组织乙酰胆碱含量，从而恢复胆碱能神经系统功能。

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