神经生长因子、尼莫地平对糖尿病周围神经病模型大鼠坐骨神经乙酰胆碱酯酶活性的影响

王云浩 陈清汉 (郑州大学第二附属医院骨科，河南 郑州 450014)

糖尿病性周围神经病在糖尿病(DM)慢性并发症中常见，其药物治疗主要为控制血糖、改善神经供血、高肌醇饮食、醛糖还原酶抵制剂治疗等，常用药物有:①尿激酶;②蝮蛇抗栓酶;③藻酸双脂钠;④醛糖还原酶抑制剂;⑤钙拮抗剂;⑥谷胱甘肽;⑦神经节苷脂;⑧前列腺素E1胶囊;⑨神经生长因子;⑩中草药等〔1～3〕。本实验研究钙拮抗剂、神经生长因子(NGF)对糖尿病周围神经病模型预处理大鼠坐骨神经乙酰胆碱酯酶(AchE)活性的影响，探讨其促进神经再生的机制。

1 材料及方法

1.1 动物 清洁级雄性SD大鼠，质量190～210 g，合格证号:SCXK鲁20130001，由山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室供给。

1.2 试剂与仪器 链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，批号:S01301)、重组鼠 β 神经生长因子(β-NGF，美国 Peprotech公司，批号:0307394)、尼莫地平片(Nimodipine，广东华南药业集团有限公司批号:120701)。

1.3 造模与分组 60只大鼠，随机取12只为空白对照组(Control)，其余用STZ造模，用0.1 mmol/L无菌枸橼酸钠缓冲液(pH 4.5，4℃)将STZ配成0.45%的溶液，按70 mg/kg的剂量标准给大鼠腹腔注射，72 h后大鼠禁食8 h断尾取血，测定血糖大于16.7 mmol/L者为成模，将成模大鼠36只，随机分为DM组、DM+NGF组和DM+Nimodipine组。为防止感染，给药后前2 w腹腔注射青霉素640 000 U/只。

1.4 给药方法DM+NGF组给予 β-NGF(200 μg·kg-1·d-1)后肢肌肉注射;DM+尼莫地平组给予尼莫地平20 mg·kg-1·d-1，使用时将尼莫地平用蒸馏水制成混悬液(10 mg/ml)灌胃，DM组分别肌肉注射和灌胃等量的生理盐水。

1.5 取材 建模成功的大鼠在0、4、8、12 w分别取材，以10%水合氯醛为麻醉剂，按350 mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后，分离大鼠双侧肌肉组织，取出两侧的坐骨神经，0.1 mol/L二甲砷酸缓冲液(pH7.4，含8%蔗糖)配制的 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛固定液续固定1 h(4℃)，缓冲液漂洗2 h。

1.6 酶组织化学 材料用恒冷箱切片机(JUNG CM1800)制成冰冻切片厚10 μm，进行组化反应。AchE酶组织化学:采用Karnovsky Roots法配制孵育液，切片置于孵育液中(37℃，60 min)反应后漂洗，甘油明胶封片，镜检。坐骨神经AchE透光度值正常值92.345 6±0.732 9。

1.7 酶活性观察及图像分析定量测量 使用LUZEX-F计算机图像分析仪(日本)测AchE酶活性，根据酶活性反应的分级标准对各组标本酶反应强弱进行活性观察及定量分析。每组随机抽取坐骨神经切片6张，每张切片3个视野，测量表示酶反应强弱的透光度值。测定视野越亮，所测值越大，表示酶活性越小，反之酶活性越大。

1.8 统计学分析 采用SPSS17.0软件，用完全随机设计资料的单向方差分析(one-way ANOVA)，Bonferroni法进行组间两两比较，并通过重复测量资料的方差分析阐明各组与时间效应的关系。

2 结果

2.1 大鼠体重和血糖 DM大鼠在STZ注射后72 h至处死前，血糖明显增高，并保持相对稳定，在β-NGF和Nimodipine干预下未见血糖明显变化。造模后DM大鼠体重增加缓慢，与Control组相比明显减轻，β-NGF和Nimodipine干预对体重变化没有明显影响。

2.2 坐骨神经AchE活性变化 Control组坐骨神经干平行排列的轴突上有棕红色AChE阳性反应产物(亚铁氰化酮颗粒)，着色轴突粗细不等，染色深浅也有差别。给药后4 w，模型组、NGF组和尼莫地平组的AchE活性均下降，轴突排列变紊乱，NGF组活性略高于其他组，差异无显著性。给药后8 w，NGF组、尼莫地平组AChE活性有所恢复，远侧段有AChE阳性反应轴突出现，NGF组AchE阳性反应轴突数量多于尼莫地平组。模型组未见明显恢复。给药后12 w，NGF组AChE阳性反应纤维数及活动基本正常，尼莫地平组AChE阳性反应轴突数量也增多，NGF组强于尼莫地平组。模型组仍未见明显恢复，见图1。

图1 各组AchE活性(×40)

2.3 坐骨神经AchE活性透光度值统计学分析结果见表1。DM+NGF组在4 w内与Control组对比无显著性差异(P＞0.05);4 w时透光度值变大，与Control组对比差异有统计学意义(P＜0.05)，与DM组、DM+Nimodipine组对比差异无显著性(P＞0.05);8 w、12 w时透光度值变小，与DM组、DM+Nimodipine组对比差异有统计学意义(P＜0.05)。DM+Nimodipine组在4 w内与Control组对比无显著性差异(P＞0.05);4 w时透光度值变大，与Control组对比差异有统计学意义(P＜0.05)，与DM组、DM+NGF组对比差异无显著性(P＞0.05);8 w、12 w时透光度值变小，与Control组、DM组、DM+NGF组对比差异有统计学意义(P＜0.05)。DM组在4 w内与Control组、DM+NGF组、DM+Nimodipine组对比无显著性差异(P＞0.05);4 w时与Control组对比差异有统计学意义(P＜0.05)，与DM+NGF组、DM+Nimodipine组对比无显著性差异(P＞0.05);8 w、12 w时与Control组、DM+NGF组、DM+Nimodipine组对比差异有统计学意义(P＜0.05)。最后经重复测量资料的方差分析得:DM+NGF组和DM+Nimodipine组在4 w以后透光度均数值随时间延长而变小(均 P＜0.05)。

表1 坐骨神经AchE活性透光度值分析结果(±s)

表1 坐骨神经AchE活性透光度值分析结果(±s)

与Control组比较:1)P＜0.05;与DM组比较:2)P＜0.05;与DM+NGF组比较:3)P＜0.05

组别 n 0 w 4 w 8 w 12 w Control组 12 95.720 5±0.520 7 94.613 6±0.714 6 94.880 1±0.731 9 94.552 6±0.397 9 DM 组 12 95.766 3±0.031 0 134.545 7±0.796 71) 145.067 2±0.737 21)3) 144.757 4±0.499 51)3)DM+NGF 组 12 95.922 6±0.602 4 125.922 2±0.651 81) 98.193 4±0.524 22) 92.639 2±0.899 02)DM+Nimodipine组 12 95.904 8±0.263 5 129.619 4±0.551 51) 110.669 1±1.042 61)2)3) 97.917 9±0.842 02)3)

3 讨论

糖尿病周围神经病的发病机制目前还不完全清楚，近年普遍认为其发生与多种因素共同作用有关，包括血管病变、代谢紊乱、NGF减少及遗传因素、自身免疫功能、血液流变学改变等等。据相关文献报道〔4～7〕，NGF在周围神经损伤后，损伤远端NGF及其mRNA平均水平增高数倍，NGF低亲和力受体表达增强，与其他一些与轴突再生的物质共同作用使再生轴突成熟及髓鞘化，达到完全再生和恢复功能的目的。此外，NGF还有调节免疫、造血、内分泌等作用非神经组织的功能，通过增进损伤神经元自身修复能力和提高非神经细胞协助修复功能等作用来促进神经损伤的修复〔8，9〕。而钙拮抗剂的使用是糖尿病周围神经病治疗学上的重要进展，尼莫地平为最常用的钙离子拮抗剂尼莫通的主要活性成分，已有大量研究证实其对于糖尿病周围神经病治疗的确切效果〔10～12〕。作用主要为增加神经血流量、改善神经缺血缺氧、增加神经内毛细血管密度、促进微血管生长、减少坐骨神经损伤后脊髓运动神经元的凋亡及Bax的表达，具有直接的神经保护作用。

AchE是一多分子型复杂蛋白质，在中枢及外周神经系统与乙酰胆碱受体一起参与完成神经-神经及神经-肌肉间动作电位的传递，是胆碱能神经元的标志酶，是生物神经传导中的一种关键性酶。AchE阳性强弱提示胆碱能神经元递质-乙酰胆碱含量及其生理功能状态。坐骨神经中含大量胆碱能神经元的有髓神经纤维，所以坐骨神经损伤后，AchE活性可反映其再生修复情况。建模成功大鼠坐骨神经损伤后，坐骨神经轴突的物质运输发生障碍，轴膜的电生理状态发生改变，逆行性改变使运动神经元的代谢发生变化，其合成AchE的量及向远侧运输AchE的能力下降，这样，坐骨神经中AchE的量就有所改变。本文结果显示，NGF和尼莫地平对损伤的坐骨神经恢复起促进作用，提示两者对坐骨神经胆碱能神经运动纤维再生起促进作用，也说明两者对损伤的运动神经元起保护和促进修复作用，其中神经生长因子作用优于尼莫地平。

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