银杏叶提取物对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化能力的影响

谷　旭，方鸿满，时舒曼，张甲第，吴　哲

(1.吉林大学口腔医院口腔修复科，吉林 长春 130021； 2.武警吉林省总队医院口腔科，吉林 长春 130052)

银杏叶提取物对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化能力的影响

谷旭1，方鸿满2，时舒曼1，张甲第1，吴哲1

(1.吉林大学口腔医院口腔修复科，吉林 长春 130021； 2.武警吉林省总队医院口腔科，吉林 长春 130052)

目的：探讨银杏叶提取物(GBE)对大鼠的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)成脂分化能力的影响，阐明GBE在细胞水平上对骨质疏松治疗及预防的意义。方法：将50、100、150、200和400 mg·L-1GBE与成脂诱导液加入到已纯化的第3代BMMSCs中(50、100、150、200和400 mg·L-1GBE组)，不加药的BMMSCs为对照组，共培养7 d，观察BMMSCs的形态学和表面抗原CD44、CD105和CD34的表达；采用油红O染色观察BMMSCs中脂滴形成情况，并对BMMSCs的成脂能力进行定量分析；采用RT-PCR法检测BMMSCs中脂肪组织脂肪酸结合蛋白(AP2)和过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)的亚型(PPAR-γ)mRNA的表达水平。结果：形态学检测，体外培养的原代BMMSCs 3 d后可见细胞呈梭形，7 d后细胞呈漩涡状生长，同向排列；表面抗原标记物染色，CD44和CD105呈阳性表达，而CD34呈阴性表达，证明其为BMMSCs；油红O染色，约7 d后显微镜下见大量脂滴形成，并随着GBE浓度的增大脂滴数量减少；与对照组比较，其他各组BMMSCs的A510值降低(P<0.05)；RT-PCR检测，与对照组比较，其他各组细胞中AP2和PPAR-γ mRNA表达水平降低(P<0.05)。结论：GBE在体外可抑制BMMSCs的成脂分化能力，且抑制能力随着GBE浓度的增高而逐渐增强。

银杏叶提取物；骨髓间充质干细胞；成脂分化；骨质疏松

骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征，致使骨的脆性增加，导致骨折发生的一种全身性骨骼疾病[1]。骨质疏松症的发生与骨髓中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)的分化有关联，如果BMMSCs过多地向脂肪细胞分化，则向成骨细胞分化的细胞数就相应减少，进而引起成骨缺陷导致骨质疏松[2]。学者们一直致力于骨质疏松的防治并尽量减小治疗过程中产生的副作用。近年来，银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract ，GBE)作为一种选择性雌激素受体调节剂受到学者们的关注[3]。本课题组前期实验证明GBE可促进BMMSCs在体外成骨分化，但有关BMMSCs在GBE作用下成脂分化能力的变化尚未见报道。本研究旨在探讨不同浓度GBE对BMMSCs成脂分化能力的影响，阐明GBE在细胞水平上对骨质疏松的治疗和预防意义。

1　材料与方法

1.1动物、主要试剂和仪器健康1周龄Wistar大鼠20只，雌雄不限，平均体质量(13±2)g，由大连医科大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SZXK(辽)2013-0003。国际通用银杏叶标准品(恒凯银杏制品有限公司，中国)，L-DMEM培养基(Hyclone公司，美国)，胎牛血清、油红O(Gibco公司，美国)、双抗、胰蛋白酶、地塞米松、IBMX、吲哚美辛、胰岛素和Trizol(Life Technologies公司，美国)；倒置相差显微镜、低温高速离心机(Eppendorf公司，德国)，二氧化碳孵箱(SANYO公司，日本)，平底96孔板、24孔板、6孔板、培养瓶15 mL离心管(Corning公司，美国)，巴氏吸管、PCR试剂盒、酶标仪(Bio-TEK公司，美国)。

1.2GBE的配置称取0.02 g GBE溶于100 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中，并溶解于10 mL L-DMEM中，分装成10份，混匀后抽滤配置成银杏叶提取液置于-20℃保存。

1.3BMMSCs的分离培养 采用全骨髓法：1周龄Wistar大鼠20只以颈椎脱臼法处死后浸泡于75%酒精消毒10 min，于超净台中取出胫骨、股骨和肱骨，用含10%双抗的PBS冲洗后，剪断双侧骨髓端，完全培养基(含15%Gibco胎牛血清和100 IU·mL-1双抗的L-DMEM基础培养基)冲洗骨髓腔。收集骨髓混悬液并用巴氏吸管吹打使其混匀，接种于细胞培养皿中，并放置于37℃，5%CO2孵育箱中培养。24 h后首次换液，以后每2 d换液1次，待细胞长至铺满皿底80%后用0.25%胰酶消化，1∶2传代至培养瓶中并改用血清浓度为10%的完全培养基。

1.4BMMSCs形态学观察及表面抗原鉴定 培养后用倒置相差显微镜观察细胞形态变化并拍照生长状况。将盖玻片进行灭菌预处理后放置于24孔板中，纯化后的第3代细胞调整细胞浓度至5×104mL-1滴到预处理好的盖玻片上，2 h后镜下观察见细胞贴壁，追加培养基。待细胞80%融合后，进行CD34、CD44和CD105抗体染色，并在荧光显微镜下观察拍照。

1.5油红O染色检测各组BMMSCs的成脂分化能力 取纯化后的第3代细胞，调整细胞浓度至每孔1.0×104，加入24孔板。待细胞融合至90%后分别加入浓度为50、100、150、200和400 mg·L-1GBE并进行成脂诱导，分别为50、100、150、200和400 mg·L-1GBE组，单纯加入成脂诱导液的细胞作为对照组，7 d后终止培养，加10%多聚甲醛固定30 min，每孔加入500 μL油红O 染色10 min，用75%酒精漂洗，除去多余的染料，干燥，镜下观察拍照。吸光度(A)值检测为油红O检测的定量测定方法，当波长为510 nm时，油红O可以较好的吸收。测定的A值表示BMMSCs成脂分化能力。油红O染色照相后，弃油红O染色液，PBS冲洗3次，每孔加入1 mL异丙醇，静置15 min，混匀，于每孔取出150 μL加入96孔板中，并于510 nm下测定A值。

1.6RT-PCR法检测各组BMMSCs中过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor，PPAR)的亚型PPAR-γ和脂肪组织脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty acid-binding protein，AP2)mRNA的表达水平 将50、100、150、200和400 mg·L-1GBE组和对照组的BMMSCs培养7 d后，使用Trizol从细胞中提取出总mRNA，并用Nano-Drop分光光度计测定mRNA浓度，按照RT-PCR Kit说明书进行逆转录为cDNA，RT-PCR检测PPAR-γ和AP2 mRNA的表达，并通过2-ΔΔCt法进行计算。

2　结　果

2.1BMMSCs的形态学 原代细胞培养24 h后见少量细胞贴壁生长，换液去除悬浮的杂质细胞，可见星形、短梭形的细胞分散贴壁生长，3 d后可见细胞呈放射状排列，成梭形，见图1A(插页六)。7 d后可见细胞呈片状生长排列紧密，融合度达90%，呈漩涡状生长，同向排列，可见少数圆形的细胞或胞体较大且折光率高的细胞贴附在其中，见图1B(插页六)。

2.2BMMSCs表面抗原鉴定 细胞表面抗原染色，分离纯化后的第3代BMMSCs细胞表面抗原CD44和CD105呈阳性表达，CD34呈阴性表达，见图2(插页六)。

2.3各组BMMSCs成脂分化能力 成脂诱导7 d后，镜下观察各组脂肪细胞内均有橙红色脂滴形成，大小不等，胞核被挤于一侧。脂滴数目随GBE浓度的升高而逐渐减少。见图3(插页六)。

2.4各组BMMSCs的A510值与对照组(0.133±0.020)比较，50、100、150、200和400 mg·L-1GBE组BMMSCs的A510值(0.112±0.007、0.096±0.003、0.092±0.006、0.084±0.012和0.067±0.001)随着GBE浓度的升高而降低(P<0.05)，除100与150 mg·L-1GBE组外，其他各组BMMSCs的A510值两两比较差异均有统计学意义(P<0.01)。随着GBE浓度的升高，BMMSCs的A510值逐渐降低。

2.5各组BMMSCs中PPAR-γ和AP2 mRNA表达水平各组BMMSCs中PPAR-γ和AP2 mRNA表达水平随着GBE浓度的升高而逐渐降低。单因素方差分析，与对照组比较，其他各组BMMSCs中PPAR-γ、AP2 mRNA表达水平降低(P<0.05或P<0.01)。见表1。

表1各组BMMSCs中PPAR-γ和AP2 mRNA表达水平

Tab.1Expression levels of PPAR-γ and AP2 mRNA in BMMSCs in various groups

GroupPPAR-γmRNAAP2mRNAControl1.00±0.021.00±0.08GBE(mg·L-1) 500.77±0.01**0.61±0.09* 1000.45±0.01**0.29±0.02* 1500.31±0.02**0.24±0.04** 2000.17±0.02**0.14±0.01** 4000.09±0.018**0.09±0.02**

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

3　讨　论

研究[4]显示：骨质疏松的一个重要机制是以牺牲成骨为代价的成脂分化增加，从而导致骨量的降低，骨髓腔中BMMSCs分化形成脂肪细胞，其在骨质疏松发病及治疗中的作用引起了学者们的关注。因此寻找一种能够促进BMMSCs向成骨分化、抑制其向成脂分化的药物来治疗骨质疏松及相关骨疾病是一个新的研究方向。

Oh等[5]发现：GBE有刺激成骨细胞在体外分化和成骨的功能，提示GBE可用于骨质疏松的治疗。本实验选择的是符合国际通用GBE标准品，按照德国Schwabe专利工艺生产的EGb761，其中黄酮占24.0%、萜内酯占6.0%、白果酸<0.000 5%、原花青素类占7.0%、羧酸类占13.0%、儿茶素类占2.0%、非黄酮苷类占20.0%、高分子化合物占4.0%，其他成分占3.0%[6]。本课题组前期实验已明确GBE有促进BMMSCs向成骨细胞分化及促进成骨细胞成骨的功能。本实验结果进一步证实：GBE可以有效抑制BMMSCs向脂肪细胞的分化，且其抑制作用呈现明显的浓度依赖性。

BMMSCs的筛选有多种方法[7-12]，本实验采用全骨髓细胞接种法，可减少反复离心对细胞的损伤，更会较好地保留BMMSCs的生物学特性，抗原染色[13～14]结合细胞形态和生长特性证明本课题组提取的BMMSCs无误。本实验选用15%完全培养基进行原代培养，10%完全培养基进行传代培养[15]，这样既有利于缩短培养周期，同时可保证使细胞处于良好的状态。

PPAR的亚型PPAR-γ属激素核受体超家族成员，主要在脂肪组织中表达，是诱导脂肪细胞特异性基因表达和调节脂肪细胞分化的重要因子。AP2是PPAR-γ下游的涉及到脂类储存并调节脂类代谢的靶基因，PPARγ和AP2 mRNA是BMMSCs成脂分化的较特异性的标记物，其表达可直接反映成脂分化情况[16]。本研究结果显示：与对照组比较，各浓度GBE组BMMSCs中PPAR-γ和AP2 mRNA表达水平降低，并呈浓度依赖性，表明GBE可明显抑制BMMSCs向脂肪细胞的分化，并与GBE浓度有关联。结合本课题组前期实验结果可得知：GBE对BMMSCs的分化调节有双向性，在促进BMMSCs成骨的同时又抑制BMMSCs成脂。

有研究[17-19]显示：BMMSCs中的Wnt信号通路的激活可促进成骨细胞分化转录因子Runx2的表达，抑制脂肪分化转录因子PPAR-γ的表达。GBE对BMMSCs分化的双向性调节是否与Wnt信号通路有关联，或是与其他信号通路有关是下一步实验研究的重点，其具体机制有待进一步研究。

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Effect of Ginkgo biloba extract on adipogenic differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells in rats

GU Xu1,FANG Hongman2,SHI Shuman1,ZHANG Jiadi1,WU Zhe1

(1.Department of Prosthodontics,Stomatology Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China；2.Department of Stomatology，Armed Police Military Hospital, Jilin Province,Changchun 130052,China)

Objective To study the effect of Ginkgo biloba extract (GBE) on the adipogenic differentiation ability of the bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSCs)，and to clarify its significance in treatment and prevention of osteoporosis at the cell level. MethodsThe third generation of BMMSCs were cultured with adipogenic induction solution(control group),and 50,100,150,200, and 400 mg·L-1GBE(50,100,150,200, and 400 mg·L-1GBE groups) for 7 d.The morphology of BMMSCs and the expressions of surface antisgens CD44,CD105, and CD34 were observed;the formation of lipid droplet in the BMMSCs was observed by Oil Red O staining;the quantitative analysis of the adipogenic ability of the BMMSCs was performed;RT-PCR method was used to test the expression levels of fatty acid-binding protein(AP2) and peroxisome proliferator activated receptor-γ(PPAR-γ) mRNA. ResultsThe morphological detection results showed that the BMMSCs were spindle shaped after culturedinvitrofor 3 d ,and grew in whorls and arranged in the same direction after cultured for 7 d.The surface antigens CD44 and CD105 showed positive expression,and CD34 showed negative expression,which proved the BMMSCs were extracted correctly;the Oil red O staining results showed a large of lipid droplets which was seen under microscope,and the number of lipid droplets was reduced with the increasing of the concentrations of GBE; compared with control group,the A510values of the BMMSCs in other groups were decreased(P<0.05).The RT-PCR results showed the expression levels of AP2 and PPAR-γ mRNA were decreasd in other groups compared with control group (P<0.05). Conclusion GBE can inhibit the adipogenic differentiation ability of BMMSCsinvitro,and the inhibitory ability is enhanced with the increasing of GBE concentration.

Ginkgo biloba extract；bone marrow mesenchymal stem cells；adipogenic differentiation；osteoporpsis

1671-587Ⅹ(2015)02-0343-04

10.13481/j.1671-587x.20150227

2014-11-30

吉林省科技厅自然科学基金资助课题 (201215052);吉林省科技厅科技发展计划项目资助课题(20140520051JH)；吉林省发改委科研项目资助课题(2013C023-5)

谷旭(1983-)，男，吉林省四平市人，主治医师，在读医学硕士，主要从事口腔修复和组织工程学方面的研究。

吴哲，教授，硕士研究生导师(Tel：0431-88796018，E-mail：lcwztt@sina.com.cn)

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