急性髓系白血病患者白血病细胞CD34和CD38抗原的表达及其临床意义

魏姗姗，周茂华，李劲高，陈 景，陈少贤，李 倩，夏平方，彭 琪，佘妙容

（1.南方医科大学第二临床医学院内科，广东 广州 510515；2.广东省人民医院血液科 广东省医学科学院，广东 广州 510080；3.广东省人民医院检验科 广东省医学科学院，广东 广州 510080；4.中山大学孙逸仙纪念医院肾内科，广东 广州 510120；5.广东省人民医院病理生理学研究室 广东省医学科学院，广东 广州 510080）

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一类高度异质性疾病，致死率高，尽管目前的治疗已大大提高了患者的完全缓解率（complete remission rate，CRR）（50%～75%），但最终仍有超过60%的患者复发死亡。AML患者预后与初诊时年龄、白细胞（white blood cell，WBC）计数、继发性AML、FAB分型、细胞遗传学和分子学改变等因素有关联，其中细胞遗传学及分子学改变如Fms样酪氨酸激酶3／内部串联重复（Fms－like tyrosine kinase－3／internal tandem duplication，FLT3／ITD）［1］、核仁磷酸蛋白1（nucleophosmin 1，NPM1）［2－3］、Wilms肿瘤易感基因（Wilms tumor type 1，WT1）［4］、t（8；21）和核心结合因子（core binding factor，CBF）等对患者预后尤为重要。美国国家综合癌症网（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）已依据细胞遗传学和分子学改变对初诊AML患者进行危险度分级，但有CBF改变的预后良好患者仍有一半最终复发死亡［5］，而FLT3／ITD在不同年龄患者中预后不同［6］，因此以上因素不能全面准确地评估所有患者的预后，仍需进一步探讨其他影响患者预后的因素。白血病难治复发的根源是白血病干细胞（leukemia stem cells，LSCs）［7－8］，目前公认的LSCs免疫表型是CD34＋CD38－型［9－10］，与正常造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSCs）免疫表型一致。国内虽有相关文献［11］报道CD34＋CD38－型细胞与AML预后相关，但未排除年龄和诱导方案等对患者预后的影响，中国AML患者白血病细胞CD34＋CD38－抗原表达与预后的关系仍需进一步验证。本研究回顾性分析初诊AML患者CD34＋CD38－抗原表达与患者预后的关系，为指导选择个性化、合理化的治疗方案提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2009年1月—2013年11月广东省人民医院（广东省医学科学院）血液科收治的94例初诊AML患者的临床资料。纳入标准：所有患者均经骨髓细胞形态学、组织细胞学染色和免疫组织化学检测确诊，按FAB分类法分型。排除标准：急性早幼粒细胞白血病（M3）；年龄大于60岁；已接受过化疗或放疗；继发于骨髓增生异常综合征或并发其他骨髓增殖性肿瘤者。纳入患者首次诱导治疗方案为IA方案。患者表达CD34＋CD38－抗原者36例，年龄14～60岁，中位年龄为41岁，表达CD34＋CD38＋抗原者58例，年龄16～60岁，中位年龄为42.5岁。2组患者的性别、年龄、FAB分型、初诊时 WBC计数大于50×109L－1人数、WBC计数、危险度分级和移植人数比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。2组患者巩固治疗方案具有一致性。

1.2 化疗及支持治疗 IA方案：第1～3天静脉滴注伊达比星（IDA）8～10mg·m－2·d－1，第1～7天静脉滴注阿糖胞苷（Ara－c）100～200mg·m－2·d－1。诱导治疗部分缓解（partialremission，PR）者继续给予IA方案诱导治疗1个疗程，未缓解（non－remission，NR）者给予FLAG方案或者CAT方案诱导治疗（FLAG方案：第1～5天静脉滴注氟达拉滨30mg·m－2·d－1，第1～5天静脉滴注Ara－c 1～2g·m－2·d－1，滴注时间为3h，氟达拉滨用后4h使用，第0～5天皮下注射G－CSF 200μg·m－2·d－1；CAT方案：第1～3天静脉滴注环磷酰胺300～500mg·m－2·d－1，第2～6天静脉滴注 Ara－c 1.0～1.5g·m－2·d－1，第2～6天静脉滴注拓扑替康1.25mg·m－2·d－1）。完全缓解（complete remission，CR）者给予4疗程大剂量Ara－c巩固治疗（第1、3、5天每12h1次静脉滴注Ara－c 2.0～3.0g·m－2·d－1），巩固治疗结束继续交替给予NA（米托蒽醌＋Ara－c）、DA（柔红霉素＋Ara－c）和TA（吡柔比星＋Ara－c）方案序贯治疗，有条件行骨髓移植者则行异基因造血干细胞移植，复发患者给予FLAG方案或者CAT方案重新诱导治疗。化疗同时给予碱化、水化、输血和抗感染等对症支持治疗，化疗结束后第14天行骨髓象复查。

1.3 主要试剂和仪器 单克隆抗体：鼠抗人CD45PerCP、CD15FITC、CD19FITC、CD7 FITC、CD33PE、CD13PE、CD10PE、CD34 APC、HLA－DR PE、CD117APC、cCD3FITC、CD11bPE、MPO PE、CD79aPE、CD14FITC、CD64FITC、CD56PE、CD38PE、CD123PE和相应荧光标记的同型对照均购自美国BD公司，红细胞裂解液为0.83%氯化铵，洗涤液为含0.5%小牛血清的PBS，固定液为1%多聚甲醛；流式细胞仪购自美国BD公司。

1.4 流式细胞术检测细胞表面抗原的表达 取EDTA二钾抗凝骨髓50μL（约106个细胞）注入试管，加入各荧光标记的单克隆抗体，室温避光孵育20min，再向其中加入2mL裂解液，室温避光放置5～10min，离心弃上清，PBS洗涤细胞1次，加入1%多聚甲醛缓冲液0.5mL固定，24h内上机检测。髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）染色：首先加入标记的表面抗体，再加入红细胞裂解液裂解细胞10min，离心弃掉上清，加入0.5mL破膜剂室温破膜5min，PBS洗涤1次，加入MPO PE抗体孵育30min，PBS洗涤，24h内上机检测。每次检测前先用CellQuest软件获取10000个细胞，用CD45／SSC设门识别白血病细胞群和各有核细胞群，分析白血病细胞群在各种分化抗原中的表达和图形。其中CD34、CD38抗原的表达大于20%即为阳性表达。

1.5 疗效评估 主要终点评价指标为总生存时间（overall survival，OS）、无病生存时间（disease－free survival，DFS）、1年生存率和2年生存率，次要终点评价指标为CRR、总复发率和1年内复发率。疗效标准参照张之南主编的第2版《血液病诊断及疗效标准》［12］。OS是指患者确诊到任何原因出现死亡的时间间隔。DFS是指患者首次诱导治疗完全缓解直至观察到疾病进展或任何原因死亡的时间间隔（以发生在先的时间为主）。1年、2年生存率是指经过治疗后，在第1年、第2年尚存活的患者数所占总人数的比例。CR标准：①临床无白血病浸润所致的症状和体征；②血象，血红蛋白≥100g· L－1（男），或≥90g·L－1（女），中性粒细胞绝对值≥1.5×109L－1，血小板≥100×109L－1，外周血白血病细胞分类中无白血病细胞；③骨髓原始细胞≤5%。PR标准：骨髓原始细胞＞5%而≤20%，或临床症状、血象中有1项未达CR者。NR标准：骨髓象、血象和临床症状均未达到上述标准。复发标准：经治疗获CR者出现以下情况之一，①骨髓原始细胞＞5%而≤20%经有效抗白血病治疗1个疗程仍未达骨髓象完全缓解标准者；②骨髓原始细胞＞20%者；③骨髓外白血病细胞浸润。

1.6 随访方法及时间 随访起点为疾病确诊日期，2014年8月1日为随访截止日期；随访方式为门诊或住院复查记录；随访内容包括一般情况、临床症状、血常规和骨髓涂片。本组随访率为90.4%，随访时间为1.1～64.9个月，中位随访时间为15.6个月。数据截止时未复发或死亡的患者作为删失值处理。

1.7 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析。患者年龄、WBC计数采用中位数（M）及最小～最大值（Min～Max）表示；2组患者FAB分型和危险度分级组间比较采用Mann－Whitney U 检验；研究对象性别、WBC＞50×109L－1人数、造血干细胞移植人数、CRR和复发率等计数资料组间比较采用χ2检验；Kaplan－Meier方法描述患者生存曲线。2组患者OS、DFS和生存率比较采用Log－rank检验。

2 结 果

2.1 2组患者的CRR 共有78例患者达到CR，其中 CD34＋CD38－组28 例（28／36，77.8%），CD34＋CD38＋组50例（50／58，86.2%），2组患者诱导治疗后的CRR比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 2组患者的复发率 总复发率可评估患者69例（9例患者失访），共26例患者复发，其中CD34＋CD38－组14 例（14／26，53.8%），CD34＋CD38＋组12例（12／43，27.9%），2组 患者总复发率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。1年内复发率可评估患者74例（2例失访，2例随访时间低于1年），CD34＋CD38－组复发患者9例（9／25，36.0%），CD34＋CD38＋组复发患者7例（7／49，14.3%），2组患者1年内复发率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 2组患者中位OS CD34＋CD38－组患者中位OS为13.60个月，CD34＋CD38＋组中位 OS为20.33个月，2组患者中位OS比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 2组患者中位OS示意图Fig.1 Schematic diagram of median OS of patients in two groups

2.4 2组患者中位DFS CD34＋CD38－组患者中位DFS为12.87个月，CD34＋CD38＋组患者中位DFS为33.93个月，2组患者中位DFS比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

2.5 2组患者1年和2年生存率 CD34＋CD38－组患者1年和2年生存率分别为52.8%和38.9%，CD34＋CD38＋组患者1年和2年生存率分别为75.9%和48.3%，2组患者1年和2年生存率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

3 讨 论

图2 2组患者中位DFS示意图Fig.2 Schematic diagram of median DFS of patients in two groups

图3 2组患者1年（A）和2年（B）生存率示意图Fig.3 Schematic diagram of 1－year（A）and 2－year（B）survival rates of patients in two groups

LSCs起源于HSCs，具有HSCs样自我更新复制功能，研究［13］显示：95%LSCs处于G0期，而常规的化疗药物仅能杀死增殖期LSCs，对静止状态下的LSCs缺乏杀伤作用，使LSCs得以逃避杀伤，最终导致白血病复发，因此LSCs是白血病复发的根源。早期Bonnet等［10］发现：LSCs免疫表型是CD34＋CD38－；本课题组研究［14］亦证实：高表达CD34＋CD38－抗原的KG1a细胞具有干细胞特性，可通过多种机制抵抗杀伤，因此，初诊AML患者高表达CD34＋CD38－抗原必定造成化疗后更多的微小残留（MRD），而MRD是AML预后的强有力指标，故初诊AML患者白血病细胞表达CD34＋CD38－抗原可能影响其预后 。

研究［15－17］显示：CD34＋CD38－抗原的表达与小儿AML、急性淋巴细胞白血病（ALL）预后有关联，表达 CD34＋CD38－抗原者预后不良。2005年Van Rhenen等［18］提出荷兰成人初诊AML患者白血病细胞CD34＋CD38－抗原的表达与预后有关联，高表达CD34＋CD38－抗原者 MRD多，患者预后差。鉴于不同疾病的预后可能有种族差异，本研究以中国人群为研究对象，纳入性别、年龄、FAB分型、初诊时 WBC＞50×109人数、WBC计数和危险度分级均具有一致性的CD34＋CD38－、CD34＋CD38＋患者进行重复验证，2组患者诱导方案均为IA方案。本研究结果显示：CD34＋CD38－组患者CRR与CD34＋CD38＋组比较差异无统计学意义，结果与Zhang等［19］的研究结果不一致。Zhang等［19］发现：CD34＋CD38－抗原的表达与AML患者首次诱导CR有关联，高表达CD34＋CD38－抗原者化疗结束第7天骨髓幼稚细胞比例偏高，CRR偏低。本研究诱导方案为IA方案，而Zhang等［19］诱导方案为HAD（高三尖杉酯碱＋Ara－c＋柔红霉素）、DA、NA、HAA（高三尖杉酯碱＋Ara－c＋阿克拉霉素）或MAC（米托蒽醌＋Ara－c＋环磷酰胺）方案，而首次诱导方案不同，患者CRR可能不同，故本研究结果与Zhang等［19］研究结果不一致可能和其诱导方案不同有关联。本研究结果与 Wang等［11］的研究结果一致，Wang等［11］的研究诱导方案为IA方案和DA方案，纳入患者的年龄14～71岁，由于高龄（年龄＞60岁）已作为患者预后的独立危险因素，本研究纳入的患者年龄为14～60岁，本研究进一步肯定Wang等［11］的研究结果，为指导初诊AML患者的预后指标提供了依据。

本研究中CD34＋CD38－组患者总复发率为53.8%、1年内复发率为36.0%，均高于CD34＋CD38＋组（27.9%和14.3%），与Wang等［11］的研究结果一致。Wang等［11］研究结果显示：白血病细胞表达CD34＋CD38－抗原者复发率达47.62%，而表达CD34＋CD38＋抗原者复发率仅为11.1%。目前多项研究［18－20］表明：骨髓白血病细胞表达CD34＋CD38－抗原患者的 MRD明显高于表达CD34＋CD38＋抗原患者，MRD是监测患者早期复发的重要指标，MRD越多，复发风险越大，复发率越高。此外，Plesa等［21］还发现：与表达CD34＋CD38＋抗原者比较，表达CD34＋CD38－抗原者行自体HSCs移植复发时间早，生存期短。

本研究中CD34＋CD38－组患者中位OS和中位DFS 为 13.60和12.87个月，明显短于CD34＋CD38＋组患者（20.33和33.93个月），此外CD34＋CD38－组患者1年和2年生存率分别为52.8%和38.9%，亦明显比CD34＋CD38＋组患者（75.9%和48.3%）低，表明白血病细胞表达CD34＋CD38－抗原者生存率低于表达CD34＋CD38＋抗原者。由于耐药机制的存在［22－23］，AML复发患者再次诱导CRR降低，OS缩短，因此CD34＋CD38－组患者高复发率必然导致生存率低，生存时间缩短。

综上所述，初诊AML患者白血病细胞表达CD34＋CD38－抗原提示预后不良，初诊AML患者应尽可能行流式细胞术检查骨髓CD34＋CD38－抗原的表达，并与已知预后因素相结合全面评估患者预后，其他影响患者预后的因素也需进一步探索。

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