一氧化氮抑制剂对金黄地鼠体外囊胚培养中囊胚孵出的影响

杨爱军，王雪楠，潘晓燕，于春娜，郝翠芳

（1.青岛大学医学院，青岛 266071；2.济宁医学院附属医院生殖医学科，济宁 272029；3.吉林医学院组织学与胚胎学教研室，吉林 132013）

以IVF-ET 为代表的辅助生殖技术（ART）是治疗不孕不育症的重要手段，在IVF-ET 的常规治疗中，一般移植2～3个第3天的胚胎，目前临床妊娠率只有30%～45%［1］，并易引起多胎妊娠。为了提高妊娠率和降低多胎妊娠的风险，单囊胚移植逐渐受到世界各国生殖中心的关注［2］。在正常囊胚的孵化过程中，其必须先分泌许多蛋白酶，消化透明带产生小缺口，扩张囊胚才能经此缺口孵出，这些组织蛋白酶称为“破壳蛋白”［3］。蛋白酶分泌量的多少对于扩张囊胚的孵出至关重要。

Fong等［4］的研究表明，体外培养的囊胚约有54%的囊胚不能从透明带中孵出，因此降低了胚胎的着床率。为提高囊胚的孵化率，虽已采用多种辅助孵化技术，但其对胚后期发育造成了许多不良影响：激光辅助孵化可能会因其热效应而影响胚胎发育；化学法对胚胎有毒，其使用的酸性Tyrodes溶液对分裂中期囊胚细胞的纺锤丝有毒害作用［5］。因此，提高受精囊胚的自然孵化率是解决问题的关键。一氧化氮（NO）作为调控胚胎发育的重要信号分子，通过旁分泌和自分泌的形式调控着胚胎各阶段的发育。Sireesha等［6］发现地鼠囊胚分泌的组织蛋白酶P和L（cathepsin P和cathepsin L）在囊胚孵化过程中起着重要的作用，组织蛋白酶的表达被抑制可直接阻止囊胚的孵化。因此，阐明组织蛋白酶表达分泌的调控途径，将会有效地控制扩张囊胚的孵化。Liao等［7］研究表明中性粒细胞分泌组织蛋白酶的功能受NO／cGMP通路的调控，说明NO／cGMP信号通路在调控囊胚的发育过程中起了重要作用，但对囊胚孵化的作用尚缺乏研究。

本研究将探讨NO 与囊胚孵化率的关系以及组织蛋白酶mRNA 的表达与囊胚孵化的关系，为提高囊胚自然孵化率寻找实验基础和理论依据。

材料与方法

一、实验动物

雌性金黄地鼠，8～12周龄，20只；雄性金黄地鼠，10～13周龄，20只；由长春高新医学实验动物研究中心提供；清洁级条件下饲养1 周后用于实验。饲养条件为：温度为20～22℃，湿度为40%～60%，光照周期（白天光照14h，夜间黑暗10h）。自由饮水取食。

二、试剂

孕马血清（PMSG）和绒毛膜促性腺激素（HCG）均购买于宁波第二激素厂；Trizol（Invitrogen life technologies公司，美国）；DEPC（AMRESCO E174，美 国）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas 公 司，立 陶 宛）；SYBR Premix Ex Taq kit试剂盒（TaKaRa公司，大连）；引物由华大基因合成；L-NAME（Sigma公司，美国），其它试剂均购买于Sigma公司。

三、实验方法

1.卵母细胞的体外受精和受精胚的体外培养：阴道涂片连续观察3个发情周期正常，于发情前期对雌性地鼠进行超排处理，腹腔注射HCG 20U／只，15h后脱颈椎处死，分离输卵管，清洗后撕开膨大部，收集卵丘卵母细胞复合体（COCs）于人输卵管液（HTF）滴盘中。10～13周龄的雄性地鼠，颈椎脱臼处死后，连同附睾一起取出睾丸，分离出精子，放入HTF获能液中获能，调整精子浓度为（0.5～1）×106个／ml，精卵共孵育6h后，将受精卵（光学显微镜下观察到双原核）移入平衡好的KSOMAA液滴中清洗3次，对照组将受精卵置入M199培养液中，实验组在M199培养液中添加10 mmol／L 一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME），37℃、5%CO2的饱和湿度条件下培养96h，统计对照组和实验组囊胚的孵化率（囊胚的孵化率＝孵化的囊胚数／总的囊胚数），统计囊胚细胞总数。

2.测定NO 的产生量：收集两组D4的胚胎培养液，取20μl培养液测定NO 的浓度，每组测定20个液滴，按照NO 测定试剂盒的方法制作标准曲线，计算培养液中NO 的含量［8］，采用NO 测定试剂盒，利用传统的Griess法检测。

3.统计囊胚的细胞总数：收集囊胚，对囊胚细胞核进行荧光染色，统计囊胚的细胞总数。

4.组织蛋白酶mRNA 表达水平检测：收集两组D4 的囊胚，用Trizol提取细胞总RNA，对总RNA 进行纯度、浓度及完整性测定，通过反转录试剂盒反转录成cDNA。引物由primer5.0 软件设计，组织蛋白酶L（cathepsin L）和cathepsin P的引物序列如表1所示（由华大基因合成）。用实时荧光定量PCR（SYBR Green法）进行扩增，实验操作按产品说明书进行。扩增循环程序为：95℃5 min；（95℃30s，55℃30s，72℃30s），35个循环，每个样品一个重复。实时定量PCR（Real Time PCR）反应体系为：2×Real Master Mix 10.0μl，上游引物1μl，下游引物1μl，DNA 模板1.8μl，超纯水6.2μl，总体积20μl。组织蛋白酶mRNA 表达水平检测实验重复次数是4次，样本量是50枚胚胎。

四、统计学分析

结 果

一、NO 的代谢水平对囊胚的孵化率和孵化质量的影响

与对照组相比，实验组囊胚培养液中NO 的产生量显著降低（P＜0.05），并且实验组中囊胚孵化率以及囊胚的总细胞数与对照组相比显著降低（P＜0.05）（表2）。

二、组织蛋白酶mRNA 的表达

cathepsin L及cathepsin P mRNA 在实验组囊胚中的表达量低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

表1 Real-time PCR引物序列

表2 两组的NO 产生量、囊胚孵化率、囊胚细胞总数的比较（±s）

表2 两组的NO 产生量、囊胚孵化率、囊胚细胞总数的比较（±s）

注：与对照组相比，P＜0.05

组 别 例数 NO 的产生量（μmol／L） 囊胚孵化率（%） 囊胚的细胞总数（个）80 7.2±0.7 78.2±2.6 47.0±3.5实验组 80 4.5±0.5＊ 23.5±4.7＊ 31.0±4.1对照组＊

表3 两组cathepsin L和cathepsin P mRNA 在囊胚中的表达（±s）

表3 两组cathepsin L和cathepsin P mRNA 在囊胚中的表达（±s）

注：与对照组相比，＊P＜0.05

组 别 例数 cathepsin L／β-actin cathepsin P／β-actin对照组80 0.70±0.08 0.86±0.12实验组 80 0.25±0.07＊ 0.35±0.05＊

讨 论

NO 作为调控胚胎发育的重要信号分子，在囊胚的发育过程中起了重要作用［7，9］，NO 对植入前 囊胚的作用是通过cGMP信号通路起作用的。Tranguch等［10］研究表明代谢NO 水平高的胚胎具有高的囊胚发育率和种植率。本实验中实验组添加NOS抑制剂L-NAME后，NO 的产生量明显降低，囊胚的孵化率以及囊胚细胞的总数也明显减少。因此推测囊胚孵化率降低可能是由于NO 的产生量减少而导致的，NO 产生量的降低会影响胚胎的发育潜能。

囊胚的成功孵出是IVF-ET 手术妊娠的一个重要因素，孵出失败会降低辅助生殖技术的成功率。正常的体内受精胚发育到囊胚阶段后，囊胚分泌的组织蛋白酶将透明带消化使囊胚得以孵出，种植入子宫内膜，从而获得正常妊娠。因此组织蛋白酶在囊胚的孵化和着床的过程中起着重要的作用［11］。有研究表明中性粒细胞分泌组织蛋白酶的功能受NO／cGMP通路的调控［7］。本研究结果表明实验组加入NOS 的抑制剂水平明显降低，因此推测L-NAME可能通过下调cathepsin L 和cathepsin P的表达降低囊胚孵化率，从而引起胚胎着床失败。Sireesha等［12］也在金仓鼠囊胚透明带和滋养层检测到cathepsin L 和cathepsin P 的 表 达，抑 制cathepsin L和cathepsin P 的表达可阻断囊胚孵化，说明cathepsin L和cathepsin P的表达量在囊胚的孵化过程中起着重要的作用。本实验与其结果一致，说明cathepsin L 和cathepsin P 在囊胚的孵化过程中起着至关重要的作用。

Sharma等［13］研究表明中性粒细胞分泌组织蛋白酶的功能受NO／cGMP 通路的调控，NO／cGMP通路在组织蛋白酶的分泌过程中起了重要作用。本实验的结果表明：L-NAME 抑制NO 的产生，有可能是通过NO／cGMP信号通路，降低cathepsin L和cathepsin PmRNA 的表达水平，最终导致囊胚孵化率的降低。

［1］ 庄广伦 主编.现代辅助生殖技术［M］.北京：人民卫生出版社，2005.240-241.

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