一种新的活动精子浓度计数方法

李福平，刘博

（四川大学华西第二医院，成都 610041）

精子浓度为评价男性生育能力最重要的指标之一，但由于各实验室使用检测方法不同，实验室结果有很大的变异。WHO 推荐的方法为精液标本经过稀释，通过血球计数板进行计数，但发现该方法检测结果变异较大［1］。随着Makler板的发明和计算机的普及，计算机辅助精液分析系统（CASA）是当前最方便和常用的方法［2］，由于CASA 浓度测定由系统软件决定，检测的重复性和一致性较人工计数方法有很大的提高，但参数选择范围大，对非精子成分识别能力差，因此，准确性也会存在一定范围的偏差［3］。随着男科实验室质控的不断发展，已知浓度的乳胶珠溶液逐渐应用于精液浓度检测的质控，但精子是具有运动功能的特殊细胞，质控珠可以对计数板和重复性操作进行很好的控制，但它不能完全模拟人工或CASA 计数精子的过程，没有真正实现精子浓度检测的质量控制［4-5］。所以精子浓度的检测方法需要进一步地发展和提高，笔者根据多年的临床精液检测经验，将人工计数和CASA 相结合，总结了一个快速、准确和方便的可供临床使用的精子浓度计数方法，称为“定格法”，并与手工计数和CASA 分析系统进行比较。

一、材料与方法

1.精液标本：均来自本院男性不育门诊的患者，纳入标准为精液参数均高于参考值低限（WHO第五版［6］）的标本。患者禁欲2～7d，通过手淫收集全份精液样本，放入37℃孵箱，待精液液化后进行以下4种方法精子计数。

2.计数工具：使用的计数板为Makler（Sefi-Medical Instrument，Haifa，以色列），池深10μm，可以反复使用的精子计数池。CASA 系统为清华同方图像检测分析系统（CASAS-QH-III），BX-41 光学显微镜（Olympus公司，日本）。

3.活动精子CASA 计数法：精液液化后立即进行检测，将5μl混匀精液滴入Makler板，CASA 系统计数2次，取平均值表示计数结果。

4.活动精子人工快速计数法：在精液液化后，取5μl混匀精液滴入Makler计数板，可与CASA同步进行。根据精子分布情况，在20倍物镜下快速计数Makler板任意10格，即为精子浓度。

5.活动精子定格法计数法：取混匀的精液5μl，滴入Makler计数板，可与CASA 同步进行。Makler计数板中央有100个0.1mm×0.1mm 的小方格，利用CASA 的视频采集功能，分别在Makler计数板上小方格区域的四角和中央采集5帧图像，在修正菜单中通过肉眼计数精子个数（图1），随着计数精子格子数的增加，浓度准确性也会增高，按下列公式计算精子浓度：

图1 定格法精子计数示意图

6.制动精子人工计数法：根据《WHO》第五版推荐精子浓度检测方法，根据本实验室情况进行略微修改。为了减少稀释标本和反复取样带来的误差，直接将检测完后的标本放入65 ℃水浴灭活5min，混匀后加入Makler板计数精子浓度。

二、结果

1.活动精子定格法与制动精子人工计数比较

两种方法数据经过Kolmogorov-Smirnov正态性检验，P 值均大于0.05，可认为近似正态分布。定格法与制动精子人工计数结果显示差异无统计学意义（P＞0.05），并且有好的相关性（相关系数r＝0.810，P＜0.001）（表1）。

表1 活动精子定格法与制动精子人工计数比较

2.活动精子计数的3种方法比较

比较活动精子定格法、CASA 计数法和人工快速计数法，3种计数方法体现了良好的一致性，3种方法结果没有显著性差异（P＞0.05）。CASA 计数法与定格法比较，有极好的一致性（r＝0.957，P＜0.001）。同样经过定格法培训合格后的工作人员采用人工快速计数法计算结果有良好的一致性（r＝0.924，P＜0.001）（表2）。

表2 不同活动精子计数方法的比较

三、讨论

精子计数为精液常规分析中最重要的指标之一，现在WHO 推荐的方法为精液经过稀释制动后，利用血液计数板进行计数［6］。但该方法由于计数板的局限性和精液处理步骤繁多，导致结果重复性较差，且技术池深为0.1mm，精子往往处于不同的焦平面上，造成计数结果的误差［7］。随着检测技术发展，精液专用计数板如Makler板等的应用和普及，同时出现了CASA，使用精液原液直接进行精子浓度和活动百分率检测变为现实，且在分析精子运动方面也显示了独特的功能［8］。CASA 系统是通过光电原理，自动得到精子浓度、活力等指标，并能对精子运动轨迹特征畸形分析，CASA 有较好的重复性和一致性，是当前临床最常用的检测方法［9］。然而，由于其参数选择范围较大，对精子与非精子成分识别能力较差，会将颗粒与精子相近的杂质当做精子计数，往往导致检测结果有大的偏差。随着对男科实验室质量控制的认识越来越高，现有的质控方法如使用标准乳胶珠溶液作为质控珠，可以检测计数板，混匀和加样等操作进行质量控制，但其不能完全模拟CASA 计数精子的过程，无法达到整个精子计数过程的监控。

对于精子计数方法的研究，近年大部分学者主要集中在对不同计数板对精子计数的影响，如蔡靖等［10］报道了Makler、Leja和Microcell 3种不同类型的计数池对精子浓度结果存在明显的差异。还有人工计数与仪器自动计数之间的对比研究，如纪冰［11］比较了常用计数板与ISAS检测系统之间的差别，胡毓安等［12］报道了3种计数板与CASA 分析系统之间的比较。以上方法各有优缺点，均无法完全被代替。在选用合格的计数板后，如何得出真实、准确的精子浓度仍然没有行之有效的方法。如前所诉，精液稀释制动后计数方法，操作流程多，工作量大，结果受操作者主观影响大，不适合临床常规检测开展。使用精液原液人工快速计数，虽然方便快捷，但与检测者的熟练程度有很大相关，受操作者的主观影响更大，结果往往产生较大的变异。本研究总结的“定格法”正是在通过结合人工计数和CASA分析系统的各自特点后提出的较为有效的活动精子计数方法。原理就是利用CASA 的视频采集功能在Makler计数板视野范围不同区域分别采集图像，通过人工识别精子并进行计算，得出精子浓度。计数的格子越多，准确性越高。在本研究中，定格法与制动精子人工计数比较没有显著性差别（P ＝0.178），表明利用活动精子直接计数可以代替流程较为繁琐的制动后精子计数。用该方法对CASA 参数进行矫正，人工计数快速计数进行培训，可以使多种检测精子方法得到较高的一致性和重复性（定格法-CASAr＝0.957，定格法-人工快速计数r＝0.924）。

定格法不需对标本进行稀释和对精子制动，直接使用精液原液进行检测，同时减少了稀释和多次加样带来的误差。定格法可与CASA 和人工快速计数同时进行检测，检测条件完全相同，可以对常用的几种方法进行相互比较，相互补充。该方法简便快速，在有CASA 检测系统的实验室均可开展，便于推广。由于该方法只限于加样后如何计数精子浓度的过程，无法避免由于取精不完整、计数板差异、混匀不充分和加样等带来的系统误差。定格法是对现有的精子浓度检测方法的补充和完善，该方法的有效性和实用性还需要多中心，大样本量的进一步的研究。

［1］ Brazil C，Swan SH，Tollner CR，et al.Quality control of laboratory methods for semen evaluation in a multicenter research study［J］.J Androl，2004，25：645-656.

［2］ 沈宇泓.嘉兴地区2272例男性不育患者计算机辅助精子质量分析［J］.生殖医学杂志，2012，21：280-281.

［3］ 姜建平，郑为平，马锦洪.计算机辅助精液分析系统与人工检测精液结果的比较［J］.中华男科学杂志，2004，10：634-635.

［4］ 高选，刘晓丹，赵丽娟，等.精液分析中精子浓度室内质量控制方法的研究［J］.中华男科学杂志，2012，18：235-238.

［5］ 卢文红，梁小薇，陈振文，等.精液分析的外部质量控制研究［J］.生殖医学杂志，2011，20：490-494.

［6］ 谷翊群，陈振文，卢文红，等.世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册［M］.第5版.北京：人民卫生出版社，2010.

［7］ Johnson JE，Boone WR，Blackhurst DW.Manual versus computer-automated semen analysis.Part I.Comparison of counting chambers［J］.Fertil Steril，1996，65：150-155.

［8］ Dearing CG，Kilburn S，Lindsay KS.Validation of the sperm class analyser CASA system for sperm counting in a busy diagnostic semen analysis laboratory ［J］. Hum Fertil（Camb），2014，17：37-44.

［9］ 姜建平，郑为平，马锦洪.计算机辅助精液分析系统与人工检测精液结果的比较［J］.中华男科学杂志，2004，10：634-635.

［10］ 蔡靖，曾勇，宋成，等.3种精子计数池在计算机辅助精液分析系统中的质量评价［J］.中华男科学杂志，2009，15：241-243.

［11］ 纪冰.3种精子计数方法的比较［J］.检验医学与临床，2010，7：1752-1753.

［12］ 胡毓安，陆金春，吕年青，等.4种精子计数方法的研究［J］.中华男科学杂志，2006，12：222-224.