近海养殖牡蛎中牛磺酸含量检测方法研究

徐　莉，陈文慧，符灵梅，庄　鹏（海南省出入境检验检疫局技术中心，海南海口570311）

近海养殖牡蛎中牛磺酸含量检测方法研究

徐莉，陈文慧，符灵梅，庄鹏
（海南省出入境检验检疫局技术中心，海南海口570311）

摘要：建立超高效液相色谱检测近海养殖牡蛎中牛磺酸含量的方法。样品经水和乙腈超声波辅助提取，所得样液按给定条件采用丹磺酰氯柱前衍生，选用Agilent Extend-C18色谱柱，乙酸钠-乙腈为流动相等度洗脱，254 nm紫外波长下进行分析。牛磺酸浓度在1.0 μg/mL～20 μg/mL范围内与其相应的峰面积呈线性关系，方法的检出限为0.05 μg/mL，相对标准偏差（RSD）为1.51%～2.28%，回收率为92.2%～99.8%。

关键词：牡蛎；超高效液相色谱；牛磺酸

牡蛎（Oyster）又名海蛎子，素有“海洋牛奶”之称，是一种药食同源的海洋生物，具有较高的营养物质和一定的药理作用。据报道该类水产动物含有丰富的氨基酸，其中牛磺酸的含量几乎占所有游离氨基酸的一半[1]。牛磺酸作为人体的条件必需氨基酸，具有广泛的生物学效应，是调节正常生理功能的重要物质，如可以稳定人体细胞膜、调节渗透压、抗氧化作用以及减少胆固醇的吸收等等[2]。此外，其还具有消炎、抗病毒、镇痛之功效及一定的抗肿瘤活性[3]。在西方发达国家的医药及食品添加剂行业，牛磺酸已得到普遍的应用，近年来我国一些药品生产企业也将其应用于保健品中，由此可见牛磺酸已逐渐引起了人们的重视。

牛磺酸的检测方法主要有分光光度法[4]、滴定法、薄层色谱法[5]、氨基酸自动分析法[6]和高效液相色谱法[7-8]等，其中前4种方法易受其它物质干扰导致其使用范围受到限制。高效液相色谱法凭借其灵敏度高、能够快速对样品进行检测而得到广泛应用，柱前衍生和柱后衍生是液相色谱方法的两种前处理方式，与价格昂贵的柱后衍生相比较，前者更适合于推广使用。本文选用水-乙腈为提取液，丹磺酰氯为衍生试剂，3%盐酸溶液为终止液，采用超高效液相色谱法测定牡蛎中牛磺酸的含量。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

牡蛎：2014年8月采集于海南岛东寨港、马袅港、八所港和榆林港四大养殖海湾，清洗沥干后-20℃保存备用。

牛磺酸标准品（CAS号：107-35-7，纯度＞99%）：北京百灵威试剂有限公司；丹磺酰氯（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；浓盐酸、碳酸钠、亚铁氰化钾、乙酸锌均为分析纯。

1.2仪器与设备

UPLC液相色谱仪：美国Waters公司；超声波清洗机：德国Elma公司；HWT-108水浴锅：天津恒奥技术发展有限公司；电子分析天平AE240：上海梅特勒公司；320R冷冻离心机：UNIVERSAL公司；MS3 digital旋涡混合器：德国IKA公司。

1.3溶液配制

牛磺酸标准储备液：准确称取60.4 mg牛磺酸标准品，加水定容至25 mL，得到浓度为2.39 mg/mL牛磺酸标准储备液，使用时用水稀释至所需浓度。

丹磺酰氯衍生剂：称取50 mg丹磺酰氯，加乙腈溶解并定容至50 mL。

盐酸终止液：量取300μL盐酸溶液，加水至10mL；碳酸钠溶液（pH9.5）：称0.424 g碳酸钠溶于100 mL水中，用盐酸终止液调节pH至9.5；乙酸钠流动相（pH 4.2）：称取0.574 g乙酸钠溶于700 mL水中，乙酸调节pH至4.2。

1.4色谱条件

色谱柱：Agilent Extend C18柱（150 mm×5.0 mm× 4.6 μm）；柱温：40℃；流动相：乙酸钠（pH4.2）+乙腈（乙酸钠与乙腈体积比为65∶35）等度洗脱；流速：0.8 mL/min；紫外检测器波长：254 nm；进样量：10 μL。

1.5方法

1.5.1标准溶液的衍生

依次将牛磺酸标准工作液1.0 mL、碳酸钠溶液1.0 mL、丹磺酰氯衍生剂300 μL加入10 mL试管中，封口，置于60℃水浴中反应15 min，冷却，加入100 μL盐酸终止液，混匀，上机。

1.5.2样品的前处理

将适量样品用研磨机捣碎，称取匀浆样品1.0 g（精确至0.01 g）于25 mL比色管中，加入10 mL蒸馏水，超声提取20 min，再加入乙腈定容至25 mL，涡旋离心，吸取适量上清液，加水至1 mL，按照1.5.1步骤进行衍生化操作。

2　结果与分析

2.1提取液及沉淀剂的确定

牛磺酸是以游离形式存在于牡蛎组织中，且绝大部分存在于细胞内，需要破坏细胞壁才能使牛磺酸更好的扩散出来。文献[8]所描述柱前衍生化法中样品前处理提取液多用水溶解，然后加入不同的沉淀剂去除干扰物质。综合考虑牛磺酸易溶于水的特性及操作稳定性两方面因素，试验采取先加水超声处理再加入乙腈涡旋提取的方式进行前处理。结果表明，与直接提取相比较，超声提取的回收率显著提高，而选用乙腈作为二次提取液不仅能很好的沉淀牡蛎中的蛋白质，也能有效的促进组织中牛磺酸的浸出。考察前处理过程中水、乙腈的比例以及超声时间，最终确定水和乙腈的比例为2∶3，超声提取时间为20 min，在该条件下有效排除杂质干扰的同时也获得较佳的回收率。2.2衍生反应条件的选择

由于牛磺酸自身的紫外吸收较弱，需进行衍生化后方能提高其检测的灵敏度。丹磺酰氯作为常用的衍生剂，在与牛磺酸发生衍生反应时需要碱性催化剂的存在，试验选用pH为9.5的碳酸钠溶液取得了较好的衍生结果。此外，为了避免丹磺酰氯与牛磺酸发生进一步的反应，选择3%盐酸溶液作为反应终止液有效的抑制了链接反应的发生。试验考察了衍生反应所需的温度、时间以及衍生剂的用量3个影响因素，结果表明：过高的水浴温度会导致测定结果不稳定，平行效果差；衍生剂加入量过少会导致衍生化时间过长且不完全；因此在60℃的水浴中，加入300 μL浓度为5 mg/mL丹磺酰氯衍生剂，反应15 min时，牡蛎中牛磺酸的测定可获得较理想的回收率。

2.3色谱条件的优化

调节流动相乙酸钠-乙腈的比例发现：随着乙腈的配比加大，溶剂峰与目标峰无法分离；而当乙腈比例减少时，目标物出峰时间不断延长，但响应下降明显，灵敏度降低且峰形扁平。考虑到在流动相中，牛磺酸与丹磺酰氯生成的衍生物中游离的磺酸基会发生电离导致峰形变差，因此试验选择合适流动相配比的同时调节乙酸钠的pH，以获得较佳的分离度和峰形。试验结果显示流动相的pH为4.2，乙酸钠与乙腈的配比为65∶35时，峰面积最大，峰形对称且分离度良好，完全可以满足分析要求，对色谱柱的损害也很小。

2.4线性关系及检出限

按照1.5.1试验方法对牛磺酸标准溶液系列进行测定，得到回归方程为Y=9.98e+003X；相关系数为0.998 4，标准谱图如图1所示。

图1　牛磺酸标准品色谱图Fig.1　Chromatogram of standard of taurine

结果表明，牛磺酸的浓度在1.0 μg/mL～20 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系，以3倍信噪比计算所得待测物检出限质量浓度为0.05 μg/mL。

2.5方法精密度、重复性和稳定性

精密度是指多次测定结果的重复性，精密度常以相对标准偏差（RSD）来衡量。试验随机选取一个已处理好的样品溶液重复测定6次，结果计算所得RSD为0.56%，表明仪器的性能良好，适用于牛磺酸衍生物的分析。

为了考察所建立方法的重复性，分别称取同一海湾养殖牡蛎样品6份，按照1.5试验方法进行处理并用上述优化的色谱条件测定，计算牛磺酸衍生物峰面积的RSD为2.8%，说明该方法的重复性良好。

已完成衍生化的牛磺酸标准衍生溶液放置室温下，分别于0、6、12、24 h进行仪器测定，记录峰面积及保留时间，结果显示牛磺酸衍生物峰面积的RSD（n= 6）为1.3%，平均保留时间2.312 min，说明牛磺酸衍生物在室温条件下24 h内保持稳定。

2.6方法加标回收率

在选定的色谱条件下，准确称取已知含量的牡蛎样品，分别加入3个浓度水平的牛磺酸标准液，按照1.5.2样品前处理要求处理好样品进行测定，加标回收率和精密度试验结果见表1。

表1　样品加标回收和精密度试验（n=6）Table 1　The spiked recoveries and precision of sample

试验表明在选定的色谱条件下进样分析，所建立方法重现性好，精密度高，准确度好。

2.7样品测定

将海南岛东寨港、马袅港、八所港和榆林港四大养殖海湾的牡蛎样品分别进行超声、涡旋处理，吸取上清液后采用上述色谱方法进行检测，各养殖区域测定结果见表2，其色谱图见图2。

表2　牡蛎样品中牛磺酸含量Table 2　Determination of taurine in Ostrea by the methods

图2　牛磺酸样品衍生物的色谱图Fig.2　Chromatogram of derivate of taurine in sample

4个港口牡蛎的牛磺酸含量与文献报道新鲜牡蛎的含量15 mg/g有所差异。造成差异的原因可能是牡蛎苗产地、养殖水域的不同以及采集时间的区别，因为牡蛎等贝类自身不能合成牛磺酸，只能对牛磺酸起到积蓄作用，8月份采集的牡蛎还未达到最佳的成熟期。

3　结论

本文选用超声波处理，乙腈二次提取，丹磺酰氯为柱前衍生剂测定牡蛎中牛磺酸的含量，相比于其它所采用蛋白沉淀剂和直接提取的前处理方法应用范围更广且方法稳定性好，可适合于各种基质复杂样品的分析，大大减少了基体对检测物质出峰的干扰，操作简便、快捷，并且该方法还能有效的提高了牛磺酸的检测灵敏度和准确性。

参考文献：

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[4]李秀娟,鲁曾,黄贤刚.牡蛎中牛磺酸含量测定方法的建立[J].安全与检测,2010,26(5):81-83

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[6]吴成业,刘智禹.几种牡蛎在保鲜中游离氨基酸和牛磺酸的变化[J].中国水产科学,2000,7(3):120-123

[7]张玉玲,杨道华,张桂芝.HPLC法测定智杞颗粒中牛磺酸含量[J].湖北中医杂志,2009,31(5):56-57

[8]黄晓杰,李京华,王俊德.柱前衍生化-高效液相色谱法测定牛磺酸的条件优化[J].食品工业,2009(1):68-70

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.039

收稿日期：2014-11-05

基金项目：海南省科技兴海项目（XH201407）

作者简介：徐莉（1981—），女（汉），工程师，硕士，研究方向：食品有害物质检测。

Study in Detection of Taurine Content in Aquaculture Oyster

XU Li，CHEN Wen-hui，FU Ling-mei，ZHUANG Peng
（Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Technology Center，Haikou 570311，Hainan，China）

Abstract：An UPLC method for determination taurine in oyster was established.The samples were extracted by ultrasonic assisted water and acetonitrile，an aliquot of the acetonitrile extract was taken and taurine in the extract was pre-column derivatized with dansyl chloride under prescribed condition.The analysis condition for UPLC consist of Agilent extend-C18column，sodium acetate-acetonitrile as mobile phase elution，254 nm wavelength.Linear relationship between values of peak area and concentration of taurine（determined as its derivate）was kept in the range of 1.0 μg/mL-20 μg/mL，the detection limit was 0.05 μg/mL，the relative standard deviation（RSD）ranged from 1.51%to 2.28%，the recovery rate was 92.2%-99.8%.

Key words：oysters；UPLC；taurine