UPLC法测定咖啡豆中绿原酸和咖啡因的含量

杨清山，蔡荣华，徐　猛，王　磊，高　伟，*（.晨光生物科技集团股份有限公司，河北邯郸05750；.河北省天然色素工程技术研究中心，河北邯郸05750）

UPLC法测定咖啡豆中绿原酸和咖啡因的含量

杨清山1，2，蔡荣华1，徐猛2，王磊1，2，高伟1，2，*
（1.晨光生物科技集团股份有限公司，河北邯郸057250；2.河北省天然色素工程技术研究中心，河北邯郸057250）

摘要：建立了咖啡豆中绿原酸和咖啡因的超高效液相色谱测定方法。咖啡豆粉碎后经70%甲醇水溶液超声提取后，在Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）上以酸性乙腈水为流动相，采用紫外检测器在274 nm测定。在优化试验条件下，咖啡豆中绿原酸和咖啡因提取完全。绿原酸在88.4 mg/L～442 mg/L时峰强度与浓度成良好线性（r2= 0.999 3），相对标准偏差为2.81%，平均回收率为98.24%～99.72%。咖啡因在28.8 mg/L～143 mg/L时峰强度与浓度成良好线性（r2=0.999 8），相对标准偏差为1.34%，平均回收率为98.50%～101.32%。方法准确可靠，适用于咖啡豆中绿原酸和咖啡因含量的测定。

关键词：咖啡豆；绿原酸；咖啡因；UPLC

咖啡树是属茜草科多年生灌木或小乔木，而咖啡豆就是指咖啡树果实里面的果仁。常饮用的咖啡是用咖啡豆配合各种不同的烹煮器具制作出来的。“咖啡”（coffee）一词源自埃塞俄比亚的一个名叫卡法（kaffa）的小镇，在希腊语中“Kaweh”的意思是“力量与热情”。咖啡含有丰富的活性物质，其中绿原酸类化合物占咖啡豆干重0.2%～10%，咖啡因占2%～8%左右[1]。绿原酸是一类与人类健康密切相关的生理活性物质，其中以5-咖啡酰奎尼酸（5-O-caffeoylquinic acid，5-CQA）为主要成分。现代药理学研究表明，绿原酸类化合物具有抗氧化、抗病毒、抗癌等多种作用，同时对高血脂、高血压和动脉硬化硬化具有一定抑制作用[2-5]。咖啡因又称咖啡碱，在医药上可作麻醉剂、兴奋剂、利尿剂和强心剂[6]。龙文静等研究了咖啡豆中的绿原酸类化合物测定方法[7]，贾桂燕等研究了咖啡中绿原酸和咖啡因的测定方法[8]，李春丽等研究了咖啡豆中咖啡因的测定方法[9]。本试验建立了同时测定咖啡豆中绿原酸和咖啡因的超高效液相色谱法，方法简单快捷、稳定可靠，为咖啡豆的质量评价提供了参考。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

Waters超高效液相色谱仪，配有紫外检测器和ACQUITY UPLC H-Class系统：美国Waters公司；BP211D电子天平：德国赛多利斯公司；FZ102微型植物粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；Millipore Q超纯水器：美国Millipore公司；TH-300BQ数控超声波清洗器：济宁天华超声电子仪器有限公司。

图1　绿原酸和咖啡因标准品色谱图Fig.1　Chromatogram of chlorogenic acid and caffeine

绿原酸标准品购买于贵州迪大生物科技有限公司，纯度98%；咖啡因标准品购买于中国计量科学研究院，纯度99.8%；冰醋酸、甲醇（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；乙腈（色谱纯）：美国Fisher公司。

咖啡豆样品：晨光生物科技集团股份有限公司提供。

1.2色谱条件

色谱柱：Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40℃；样品室温度：20℃；进样量1 μL；流动相：10%乙腈水（冰醋酸调pH 2.75）；流速0.4 mL/min；检测波长：274 nm。

1.3标准品溶液的配制

准确称取单酸标准品10 mg和咖啡因标准品5 mg 至50 mL容量瓶中，用10%乙腈水定容，摇匀作为储备液；用流动相逐级稀释，依次稀释2、4、8、16、32倍，作为标准工作液。

1.4样品溶液的制备

将咖啡豆粉碎至40目通过率80%以上细度，并将筛上物和筛下物混合均匀后，作为待测样。准确称取1.000 g待测样，置于100 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液定容，室温下超声2 h，冷却后过0.22 μm滤膜，进样检测。

和咖啡因均具有吸收，因此确定检测波长为274nm。

2.2样品前处理方法的优化

2.2.1粉碎细度的选择

咖啡豆在不同粉碎次数下的40目筛过筛率情况见表1。

表1　咖啡豆粉碎试验数据Table 1　Data of coffee bean by smash test

咖啡豆质地较硬，常规粉碎方法无法满足试验要求，使称取的样品无法具有代表性或者粒度过大影响萃取效果，造成最终检测误差偏大。本试验采取多次粉碎过筛的方式，将咖啡豆粉碎至40目通过率80%以上，使每次称取的样品都具有代表性且样品在萃取过程达到最佳的效果。

2.2.2提取溶剂的选择

不同体积分数的甲醇对咖啡豆粉的提取效果情况见图2。

图2　甲醇浓度优化试验Fig.2　Optimizing test of methanol concentration

2　结果与分析

2.1检测波长的选择

绿原酸和咖啡因标准品色谱图见图1。

咖啡因最大吸收波长为272nm，绿原酸最大吸收波长为327nm，经试验发现在274nm波长条件下，绿原酸

试验分别进行了30%、50%、70%和100%甲醇对咖啡豆粉中绿原酸和咖啡因的提取效果情况。结果表明，70%甲醇提取出的绿原酸和咖啡因含量均高于其他几种提取溶剂，因此选择70%甲醇作为提取溶剂。

2.2.3提取时间的选择

不同超声时间对咖啡豆粉的提取效果情况见图3。

图3　提取时间优化试验Fig.3　Optimizing test of extraction time

试验分别进行了超声辅助提取0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h对咖啡豆粉中绿原酸和咖啡因的提取效果情况。结果表明，超声辅助提取2.0 h的提取效果最好，因此选择超声辅助提取2.0 h作为最佳提取时间。

2.2.4称样质量的选择

不同称样质量对咖啡豆粉的提取效果情况见图4。

图4　称样质量优化试验Fig.4　Optimizing test of sample weigh

试验分别进行了样品称取质量为0.500、1.000、2.500、5.000 g对咖啡豆粉中绿原酸和咖啡因的提取效果情况。结果表明，称样质量为1.000 g时的提取效果最好，因此选择称样质量1.000 g作为最佳称样量。

2.3线性关系和检出限

取“1.3”中的混合标准工作液按照“1.2”条件下检测，进行线性范围考察，以绿原酸和咖啡因的峰面积（y）为纵坐标，以质量浓度（x，mg/L）为横坐标，做标准曲线。结果表明：绿原酸在88.4 mg/L～442 mg/L时峰强度与浓度成良好线性，线性方程为y=4966567x-20076，r2=0.999 3；咖啡因在28.8 mg/L～143 mg/L时峰强度与浓度成良好线性，y=19 734 680x-55 406，r2=0.999 8。

2.4精密度试验

取“1.3”中的混合标准工作液按照“1.2”条件下进样检测，进行精密度试验，重复进样6次，测定峰面积。结果表明：标样中绿原酸和咖啡因的相对标准偏差分别为0.91%和0.68%。

2.5重复性试验

选取同一份样品，用“1.4”中方法进行制样，按照“1.2”条件下进样检测，进行重复性试验，样品重复检测6次，测定样品中绿原酸和咖啡因含量。结果表明：样品中绿原酸和咖啡因的相对标准偏差分别为2.81% 和1.34%。

2.6加标回收率试验

选取同一份样品，分别在其浓度附近进行加标，用“1.4”中方法进行制样，按照“1.2”条件下进样检测，测定样品中绿原酸和咖啡因加标回收率情况。结果表明：样品中绿原酸和咖啡因的加标回收率分别为98.24%～99.72%和98.50%～101.32%。

3　结论

综上所述，本试验确定了一种简单、快速并能准确测定咖啡豆中绿原酸和咖啡因含量的超高效液相色谱方法，为咖啡豆质量的评定提供参考方法。

本试验方法经精密度、重复性和加标回收率等试验验证，其相对标准偏差均在规定的误差范围内，说明该处理方法及色谱条件适用于咖啡豆中绿原酸和咖啡因的定量分析，方法准确可靠。

本试验建立的绿原酸检测方法只适用于咖啡豆中主要成分5-咖啡酰奎尼酸（5-O-caffeoylquinic acid，5-CQA）的含量测定，对于咖啡豆中所有绿原酸成分和咖啡因含量的同时测定需要其他学者做进一步研究。

参考文献：

[1]许善伟.高效液相法测定咖啡豆提取物中绿原酸的含量[J].广西医学,2009,31(11):1702-1703

[2]Yanagimoto K,Ochi H,Lee K G,et al.Antioxidative Activity of Fractions Obtained from Brewed Coffee[J].J of Agric and Food Chem, 2004,52(3):592-596

[3]Iwai K,Kishimoto N,Kakino Y,et al.In Vitro Antioxidative Effects and Tyrosinase Inhibitory Activities of Seven Hydroxycinnamoyl Derivativesin Green CoffeeBeans[J].Jof Agricand Food Chem,2004, 52(15):4893-4898

[4]Farah A,Paulis T,Trugo L C,et al.Effect of Roasting on the Formation of Chlorogenic Acid Lactones in Cofee[J].J of Agric and Food Chem,2005,53(5):1505-1513

[5]Jiang Y,Kusama K,Satoh K,et al.Induction of cytotoxicity by chlorogenic acid in human oral tumor cell lines[J].Phytomedicine, 2000,7(6):483

[6]黄雅志.喝咖啡能免除得胆结石的危险[J].云南热作科技,2000,1 (1):23

[7]龙文静,张盛,袁玲,等.反相高效液相色谱法同时测定咖啡豆中的6种酚酸类化合物[J].色谱,2011,29(5):439-442

[8]贾桂燕,鲁巍巍,郑毅男.咖啡中咖啡因和绿原酸的含量测定[J].黑龙江八一农垦大学学报,2008,20(3):64-67

[9]李春丽,贺明鑫.反相液相色谱法测定咖啡豆中咖啡碱含量[J].云南热作科技,2000,23(3):10-12

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.035

收稿日期：2013-12-21

基金项目：国家国际科技合作专项（S2013ZR0319）

作者简介：杨清山（1985—），男（汉），工程师，学士，研究方向：食品分析和检测。

*通信作者：高伟，博士，高级工程师，研究方向：天然产物提取。

Determination of Chlorogenic Acid and Caffeine in Coffee Beans by UPLC

YANG Qing-shan1，2，CAI Rong-hua1，XU Meng2，WANG Lei1，2，GAO Wei1，2，*
（1.Chenguang Biotech Group Co.，Ltd.，Handan 057250，Hebei，China；2.Hebei Engineering Technology Research Center of Natural Pigments，Handan 057250，Hebei，China）

Abstract：A Ultra Performance Liquid Chromatographic method was developed for the determination of chlorogenic acid and caffeine in coffee beans.Coffee bean sample was smashed and ultraphonic extracted with methanol-water（70∶30，by volumn）.The separation of chlorogenic acid and caffeine were achieved with a Waters BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column by using a mixture of acidic property acetonitrile-water as the mobile phase.The ultraviolet detector was set at 274 nm.The chlorogenic acid and caffeine in coffee bean was extracted completely.There was a good linear relationship between chromatographic peak areas and the concentrations of chlorogenic acid in the range of 88.4 mg/L-442 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 3. The RSDs of the method were in the range of 2.81%，and the average recoveries were between 98.24%and 99.72%.There was also a good linear relationship between chromatographic peak areas and the concentrations of caffeine in the range of 28.8 mg/L-143 mg/L with a correlation coefficient of 0.999 8.The RSDs of the method were in the range of 1.34%，and the average recoveries were between 98.50%and 101.32%.The results showed that the method was successfully applied in the analysis of chlorogenic acid and caffeine in coffee bean with its good repeatability and sensitivity.

Key words：coffee bean；chlorogenic acid；caffeine；UPLC