Micro RNA-146a基因多态性与慢性乙型肝炎患者抗病毒疗效的相关性

赵楚生，王奕忠，吴令杰，郭旭武

（广东省汕头市中心医院，广东汕头515031）

·临床论著·

Micro RNA-146a基因多态性与慢性乙型肝炎患者抗病毒疗效的相关性

赵楚生，王奕忠，吴令杰，郭旭武

（广东省汕头市中心医院，广东汕头515031）

目的探讨micro RNA-146a（miR-146a）基因单核苷酸多态性（SNP）和慢性乙型病毒性肝炎（CHB）患者干扰素-α（IFN-α）治疗应答反应的相关性。方法选择接受IFN-α抗病毒治疗的慢性乙型肝炎患者133例，其中应答组79例，无应答组54例。采集两组静脉血并提取DNA，用聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（PCR-RFLP）方法对miR-146a行SNP分型。结果miR-146a CT基因型与TT基因型比较，差异有统计学意义（P=0.009）；CC基因型与TT基因型比较，差异有统计学意义（P=0.029）。T等位基因与C等位基因频率比较差异有统计学意义（P=0.020）。结论MiR-146a基因多态性与慢性乙型肝炎患者抗病毒疗效相关，T等位基因或TT基因型与IFN治疗应答相关，而C等位基因或CC基因型与干扰素治疗应答无相关。

RNA；基因多态性；肝炎病毒；等位基因

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一种导致急、慢性乙型肝炎的病原体，世界上约有4亿慢性HBV感染者，其中75％为亚洲人。急性感染可导致严重致命的爆发性肝炎，慢性感染可导致肝硬化甚至肝细胞癌，所以在许多国家，这是一非常严重的问题[1]。干扰素-α（Interferon-α，IFN-α）有抗病毒、免疫调节、抗增生及基因诱导特性。应用IFN-α治疗可使CHB患者获得病毒学应答，并可改善临床结果[2]。影响IFN-α疗效的因素很多，本研究目的是探讨microRNA-146a（miR-146a）基因多态性对慢性乙型肝炎患者IFN-α抗病毒治疗应答的影响。

1 资料与方法

1.1临床资料

选取2010年1月-2013年12月本院感染科就诊的CHB患者133例，HBeAg阳性及HBV-DNA阳性，所有患者接受24～72周的普通IFN或聚乙二醇化干扰素（PEG-IFN）治疗。根据患者对IFN-α的病毒学反应分成应答组（n=79）和非应答组（n=54）例。应答组定义为治疗期间患者血清HBV-DNA＜100 IU/ml，随访1年未复发。非应答组定义为治疗期间未达到以上标准，或者达到以上标准后随访1年复发。

1.2检测方法

1.2.1 标本采集和基因组DNA提取抽取静脉血1 ml，乙二胺四乙酸抗凝外周全血。将1 ml全血加至2.5 ml抽提缓冲液中，60℃保温1 h，15 000 r/min离心10 min，上清液转入另一个新的离心管中。加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），混匀抽提至水乳胶融状。15 000 r/min离心10 min，上清液转入另一个新的离心管中。加入2/3体积的预冷异丙醇，置入-20℃冰箱保温30～60min，缓慢混匀DNA成絮状析出。15 000 r/min离心10 min，弃上清液。用70％乙醇洗2次沉淀DNA，加入400μl TE buffer溶解DNA。

1.2.2 聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性（polymerase chain reaction-restriction fragment lengthpolymorphism，PCR-RFLP）分析利用PCR-RFLP方法分析miR-146a基因多态性。其中PCR引物参照JAZDZEWSKI等[3]的报道，并行PubMed blast比对，与扩增产物符合。PCR反应体系为20μl，包括300 ng的基因组DNA，正、反向引物各0.2μmoL/L，10×PCR buffer 2μl，2.5 mmol/L dNTPs 2μl及lμl Taq DNA聚合酶（日本TaKaRa公司）。PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸30 s，共33个循环，72℃继续延伸7 min，于40℃保存。PCR产物经2％琼脂糖溴化乙锭电泳分析，100 bp DNA Marker（日本TaKaRa公司）作为参照组，验证目的片段是否扩增成功。138 bp PCR产物经限制性内切酶MspⅠ（立陶宛MBI Fermentas公司）消化，37℃、5 uEcoRⅠ过夜反应，经3％琼脂糖溴化乙锭凝胶电泳分析。单一138 bp条带代表野生型TT纯合子，双带112和26 bp代表突变的CC纯合子，3条带138、112和26 bp代表CT杂合子。为确保基因型分析的准确性，随机选取10％PCR产物进行测序，与酶切结果100％符合。

1.3统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用两独立样本的t检验，计数资料以率表示，用χ2检验，两组患者等位基因频率行Hardy-Weinberg equilibrium分析、等位基因频率比较及A值计算用χ2检验，以TT基因型作为参照，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组患者一般资料比较

两组患者年龄、性别、丙氨酸转氨酶及天冬氨酸转氨酶比较，差异无统计学意义（P=0.130、0.627、0.420和0.685）。两组患者感染HBV的途径比较，包括输血史、吸毒史、其他医疗操作或其他方面，差异无统计学意义（P=0.281），具有可比性。

2.2MiR-146a基因多态性分析

MiR-146a序列和PCR产物序列测序结果见图1。MiR-146a PCR扩增产物片段长度为138 bp。其中野生型TT纯合子不能被EcoRⅠ酶切，仍为138 bp。突变的CC纯合子可被EcoRⅠ完全酶切，产物片段为112和26 bp（因片段太小，电泳条带不清楚）。CT杂合子的扩增产物部分酶切，可见138、112和26 bp片段（因片段太小，电泳条带不清楚）。见图2。

2.3MiR-146a C/T基因多态性与患者抗病毒疗效的相关性

图1 测序结果

慢性乙型肝炎患者miR-146a基因型分布经χ2检验符合Hardy-Weinberg平衡（χ2=0.610，P=0.382），说明研究对象具有群体代表性。两组患者中miR-146a CT杂合子为主要的基因型，CT基因型与TT基因型比较差异有统计学意义[A=2.935，（95％CI：1.291，6.341），P=0.009]，CC基因型与TT基因型比较差异有统计学意义（A=3.027，95％CI：1.048，9.078，P=0.029）。应答组的T等位基因频率（64.6％）比非应答组（49.1％）高，而非应答组的C等位基因频率（50.9％）比应答组（35.4％）高，且C等位基因与T等位基因频率比较差异有统计学意义（OR=1.782，95％CI：1.028和2.914，P=0.020）。miR-146a CC基因型或C等位基因可能与慢性乙型肝炎患者抗病毒疗效欠佳有关。见附表。

图2 miR-146a C/T多态性位点EcoRⅠ酶切电泳图

附表 两组患者的miR-146a C/T基因多态性例（％）

3 讨论

IFN-α是目前治疗乙型肝炎病毒感染具有持久疗效的抗病毒药物，有抗病毒和免疫调节作用，可以清除HBV，抑制肝脏坏死性炎症，降低肝硬化或肝细胞癌的危险性。据报道，应用IFN-α治疗的患者中，HBeAg阳转率约为40％，HBV-DNA阴转率约为50％[4]。

与核苷类似物相比，IFN-α治疗疗程有限，治疗应答率偏低。寻找影响治疗反应的预测因素对制定个体化治疗方案、节省医疗成本、避免副反应，具有一定的临床意义。研究证实，高丙氨酸转氨酶水平（＞200 u/L）、女性、低HBV载量、病毒基因型（B＞C）等因素可预测HBcAg阳性的慢性HBV患者对干扰素治疗的应答，并预示良好的应答效果[5-6]。除上述影响疗效的外在因素，不同个体的遗传背景亦影响自身对药物的反应性。通过SNP的研究，可以从遗传背景的角度探讨影响疗效的预测因素，并为阐明干扰素确切的作用机制提供线索。

MiRNA是一种在机体中高度保守的20～23个核苷酸长度的非编码RNA，能够广泛地参与基因的转录后调节，包括调节生物体的生物学和各种疾病的进程[7]。其中miR-l46a作为较早发现的与免疫炎症相关的调节因子，与乙肝肝癌的易感性密切相关[8]。

本研究表明，miR-146a CT杂合子在慢性乙型肝炎患者中占优势，且CT基因型与野生TT基因型比较差异有统计学意义。CT基因型在非应答组频率较高，表明CT基因型比野生TT基因型疗效差。C等位基因与T等位基因比较差异有统计学意义，表明C等位基因或CC基因型与患者对干扰素应答欠佳或治疗后复发率高相关。MiR-146a基因多态性可能影响相关靶基因的表达，从而影响疾病对药物的疗效。下一步笔者将通过研究miR-146a的可能调控因素和相关基因表达，为慢性乙型肝炎患者个体化治疗提供理论依据。

[1]金仙玉,张新宇.乙型肝炎病毒母婴传播及其预防的研究现状[J].中华围产医学杂志,2013(7)∶258-260.

[2]江晓燕,陈明胜,刘宁.不同HBV基因型慢性乙型肝炎干扰素治疗的临床疗效[J].福建医药杂志,2013,35(6)∶78-80.

[3]JAZDZEWSKI K,MURRAY EL,FRANSSILA K,et al.Common SNP in pre-miR-146a decreases mature mir expression and predisposes to papillary thyroid carcinoma[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(20)∶7269-7274.

[4]邱宏.干扰素治疗慢性乙型肝炎临床疗效观察[J].中国慢性病预防与控制,2010,18(6)∶628-629.

[5]徐学俊.干扰素治疗慢性乙型肝炎的长期疗效观察[J].中国临床医学,2006,13(5)∶758-760.

[6]叶志典,陈勇毅,罗贤鑫,等.慢性乙型肝炎不同炎症分级与干扰素抗病毒疗效探讨[J].现代医院,2013,13(4)∶10-12.

[7]MORISHITA A,MASAKI T.MiRNA in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology Research,2014,45(2)∶128-141.

[8]侯召华.MiR146a参与HBV感染造成的肝细胞Ⅰ型干扰素应答抑制的分子机制研究[D].济南∶山东大学,2012.

（申海菊 编辑）

MicroRNA-146a gene polymorphism and antiviral therapy of chronic hepatitis B

Chu-sheng ZHAO,Yi-zhong WANG，Ling-jie WU,Xu-wu GUO
(Shantou Central Hospital,Shantou,Guangdong 515031,P.R.China)

【objertive】To investigate the relationship between the single nucleotide polymorphism(SNP)on miR-l46a gene and the treatment effects of TFN-α.【Methods】Totally 133 patients of chronic hepatitis B infection who

the treatment of IFN-α were enrolled in this study.The patients were divided into two groups:sustained virological response(n=79)group and non virological response(NVR)or recurrence(n=54)group.Blood samples were collected and chromosomal DNA was extracted.The miR-146a polymorphism was determined with the method of polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism(PCRRFLP).【Results】In our study,there was a statistical association between miR-146a polymorphism and the antiviral therapy efficacy in the hepatitis B patients.There was a statistical difference in the CT genotype and the TT genotype of miR-146a between the two groups(P=0.009).There was a significant difference in the CC genotype and TT genotype between the two groups(P=0.029).There was a significant difference in the C allele and T allele between the two groups(P=0.02).【Conclusions】These findings suggested that the SNP in miR-146a is associated with the antiviral therapy efficacy of hepatitis B patients.And the TT genotype or T alleles is associated with the response to TFN-α therapy while the CC genotype or C allele is not related to the response to TFN-α therapy or recurrence.

RNA;gene;hepacivirus;allele

R512.62

A

1005-8982（2015）35-0070-03

2014-03-27