生色底物法测定细胞色素C活力初探

刘莉莎，王悦，李京，李菲菲，范慧红Δ

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.北京诺华制药有限公司，上海 201210)



生色底物法测定细胞色素C活力初探

刘莉莎1，王悦1，李京1，李菲菲2，范慧红1Δ

(1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.北京诺华制药有限公司，上海 201210)

目的 建立生色底物法测定细胞色素C活力。方法 以3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)作为底物，在37 ℃下与细胞色素C反应15 min，终止反应后生成黄色产物，在450 nm波长处测定吸光度。实验设计采用4×4量反应平行线测定法。结果 采用生色底物法对上市细胞色素C注射剂进行活力测定，线性回归方程为Y=0.9875X-1.0221，R2=0.9996，精密度及重复性RSD值分别为1.1 %及3.6 %。结论 生色底物法操作简便，灵敏度高，采用相对法测活力避免了人为因素影响，初步可用于细胞色素C的活力测定。

细胞色素C；生色底物法；活力；底物；TMB

细胞色素C为细胞呼吸激活剂，属于细胞代谢改善药。临床主要用于各种组织缺氧的急救或辅助治疗。《中国药典》2010年版二部中收载的细胞色素C活力测定方法为酶可还原率法[1]，即利用细胞色素C的氧化还原酶特性，通过细胞色素C可被酶还原数与被化学物质还原数的吸光度之比，以此测定其活性，该方法1948年由Paul用来测定细胞色素C活性[2]。我国自1977年《中国药典》收载细胞色素C品种开始，一直沿用该方法测活力，至今未改变。作为传统酶类品种，细胞色素C的活力测定方法建立之后较难改变，研究者们也尝试着对该方法做出改进[3-6]，但仍存在一定的局限性，如新鲜的猪或牛心获取和琥珀酸脱氢酶制备操作较繁琐；琥珀酸脱氢酶混悬液引起吸光度的波动以及酶活力的高低均影响细胞色素C活力测定结果的准确性；有毒试剂氰化钾的使用；为绝对法测定细胞色素C活力。

3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB)在1976年被用于血红素或含血红素蛋白的底物检测[7]，具有高检测灵敏性和无致突变特性，目前已有关于细胞色素C的基础研究使用TMB作为底物进行活性测定[8-9]。本文尝试建立了TMB生色底物法测定细胞色素C的活力，实验设计采用4×4量反应平行线测定法，并对上市细胞色素C注射剂进行了活力测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 Molecular Devices，SpectraMax Plus384连续波长酶标仪；Mettler Toledo，XS205 Dual Range电子天平；多通道及单通道Eppendorf移液器；中国药典生物检定统计程序BS2000(中国食品药品检定研究院)。

TMB液体底物购自Sigma公司；细胞色素C标准品购自国产细胞色素C原料，按照法定标准方法自行标定活力值为100 %；细胞色素C注射剂分别购自国内3个生产企业作为供试品(厂家A、厂家B、厂家C)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 溶液制备

1.2.1 标准品溶液：精密称取细胞色素C标准品适量按照活力为100 %计算浓度，加水溶解并稀释至log剂量-反应线性范围内的4个连续浓度，一般为1.25 ～ 5.0 μg/mL，剂间比r=0.7。

1.2.2 供试品溶液：取细胞色素C注射液及注射用细胞色素C制剂，分别按照预估活力为100 %计算浓度，加水稀释至与标准品溶液相同的4个浓度。

1.2.3 1.0 mol/L硫酸溶液：量取硫酸12.0 mL，加水稀释至200 mL。

1.2.4 空白辅料溶液：称取双甘氨肽80 mg，亚硫酸钠13.3 mg，亚硫酸氢钠13.3 mg，加水溶解混匀并稀释至100 mL。

1.3 活力测定 在96孔酶标板上加样，分别为4个浓度的标准品(S1、S2、S3、S4)和供试品(T1、T2、T3、T4)，每个浓度平行做2孔，按照S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4的顺序加样，加样量10 μL。在每个加样孔中加入TMB液体底物100 μL，置于酶标仪中混匀，避光，37 ℃保温15 min。取出，每孔加入1.0 mol/L硫酸溶液100 μL终止反应。在450 nm波长处测定每孔的吸光度值。以吸光度对数值为纵坐标，标准品或供试品溶液浓度对数值为横坐标分别作线性回归，按生物检定统计法中的量反应平行线原理4 × 4法实验设计，回归项应非常显著(P<0.01)，偏离平行、二次曲线、反向二次曲线各项均应不显著(P>0.05)，可信限率(FL%)不大于10 %，可靠性测验结果通过后，计算细胞色素C供试品溶液浓度，进而计算实际活力。

1.4 专属性 按照1.2项下方法分别配制4个连续浓度的标准品溶液及供试品溶液，同时配制辅料溶液和4个相应浓度的牛血清白蛋白溶液，量取上述溶液各10 μL加入酶标板，按照1.3项下方法测定反应后的吸光度值。

1.5 线性 精密称取细胞色素C标准品适量，加水制成浓度为0.2 mg/mL的溶液，量取上述溶液1000、750、625、500、375、250、125、62.5μl分别置于10 mL容量瓶内，加水稀释至刻度并混匀，得到浓度依次为20.0、15.0、12.5、10.0、7.5、5.0、2.5、1.25 μg/mL的系列线性溶液。分别量取上述溶液各10 μL，按照1.3项下方法测定反应后的吸光度值，以吸光度对数值为纵坐标，溶液浓度对数值为横坐标，进行线性回归。

1.6 精密度及重复性 按照1.2项下方法分别配制4个连续浓度的标准品溶液及相应浓度的供试品溶液，按照1.3项下方法测定吸光度，连续测定6次，计算活力的RSD值。

按照1.2项下方法，配制连续浓度的标准品溶液，另取同一批号的供试品6份，分别配制连续浓度的供试品溶液，按照1.3项下方法测定吸光度，计算6份供试品溶液活力的RSD值。

2 结果

2.1 专属性 按照1.4项下方法测得的结果见表1。标准品溶液和供试品溶液吸光度值均随着浓度的增加而增大，而辅料溶液和不含有细胞色素C的牛血清白蛋白溶液吸光度值几乎无变化，说明反应液中只有细胞色素C可以与底物发生生色反应，而其他物质不发生反应。

表1 专属性试验吸光度结果Tab.1 Results of absorbance by the specificity test

2.2 线性 按照1.5项下方法得到线性回归方程为Y=0.9875X-1.0221，R2=0.9996。结果显示该方法细胞色素C溶液浓度在1.25～20.0 μg/mL范围内线性良好。

2.3 精密度及重复性 按照1.6项下方法计算RSD值分别为1.1 %及3.6 %，结果显示该方法精密度及重复性较好。

2.4 供试品活力测定结果 按照1.3项下方法对8批供试品的活力进行测定，在可靠性测验结果通过后，计算活力，结果见表2，同时与药典方法测得活力结果进行比较，结果显示生色底物法比药典方法测得结果普遍偏高。

表2 供试品活力测定结果Tab.2 Results of activity assay

3 讨论

3.1 原理 细胞色素C是三羧酸循环中非常重要的电子传递体，它通过铁卟啉辅基中铁原子价态转变将电子由细胞色素还原酶传递给细胞色素氧化酶，引起氧化还原反应。作为氧化还原酶，细胞色素C可与底物TMB反应生成亚胺络合物，产物具有紫外吸收，且吸光度值与细胞色素C浓度成正比，通过测定反应产物的吸光度，进而测定细胞色素C的活力。药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者，称为量反应[10]。根据量反应平行线测定法的原理及方法[11-14]，测定细胞色素C活力。

3.2 底物及检测波长的确立 考察了TMB和邻苯二胺两种底物用于测定细胞色素C的活力，发现邻苯二胺需要新鲜配制，放置过程极不稳定，易氧化使溶液显黄色，影响吸光度测定的准确性和重现性，误差较大。而TMB是市售并且按照统一配方配制而成，较为稳定。考虑到方法重现性和底物稳定性，选择TMB作为反应底物。由于TMB在细胞色素C作用下生成亚胺络合物，在450 nm波长处有最大吸收，故检测波长为450 nm。

3.3 浓度及剂间比的确立 通过2.2线性考察结果，细胞色素C溶液浓度在1.25～20.0 μg/mL范围内线性良好，考虑到紫外检测的准确性，选择反应吸光度值为0.2～1.0的溶液，对应浓度范围为1.25～5.0 μg/mL。

量反应平行线原理剂间比r=1.2 ～ 2.0，在此基础上比较剂间比分别为r=0.8、r=0.7、r=0.6和r=0.5时的反应吸光度，发现剂间比为r=0.8时，吸光度值虽然在0.2～1.0范围内，但是浓度的线性范围较窄，而剂间比为r=0.5和r=0.6时，浓度的线性范围虽然较宽但反应吸光度最低值均小于0.1，系统误差较大。因此，综合比较，剂间比为r=0.7时，较为合适。最终配制的溶液浓度为5.0、3.5、2.45、1.715 μg/mL。

3.4 反应时间的确立 考察了不同反应时间(5、10、15、20 min)测定的吸光度。发现5 min时反应不完全，加入终止液后吸光度值仍波动较大。当反应时间为10、15、20 min时加入终止液，测得吸光度值较为稳定，综合考虑反应的充分性及时间成本，选择中间时间15 min作为反应时间。

3.5 与药典方法比较 本研究尝试建立的TMB生色底物法采用标准品及量反应平行线原理检测细胞色素C的相对活力，并应用于制剂的检测，该方法排除了人为因素的影响；通过交叉加样顺序，避免了由加样顺序引起的误差；采用平行线原理计算4种梯度浓度的细胞色素C活力，而不是测定单一浓度的活力，结果更为全面可靠；计算所得几项参数(回归、偏离平行、二次曲线和反向二次曲线的P值)能够表征结果的准确性和可靠性。但由于TMB底物法对含有血红素的蛋白酶类均可以进行活性测定，因此对于细胞色素C原料及其制剂需在进行理化鉴别及紫外特征吸收峰鉴别符合规定后进行TMB生色底物法的活力测定。通过与药典方法测得的结果比较(见表2)，可以看出，生色底物法测得的结果比药典方法测得的结果普遍偏高，这可能与标准品标化为本实验室内部自行标定，未进行更合理的协作标定而导致标准品的标示量不够精确有关。

综上所述，本研究尝试建立了生色底物法测定细胞色素C活力，并采用该方法对上市的细胞色素C注射剂进行了活力测定。该方法操作简便、快速，灵敏度高，减少了人为因素的影响，避免了有毒试剂的使用，可用于细胞色素C活力测定。方法的影响因素及结果可靠性还需要进一步研究验证。

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(编校：王冬梅)

Determination of the activity of cytochrome C by the chromogenic substrate method

LIU Li-sha1, WANG Yue1, LI Jing1, LI Fei-fei2, FAN Hui-hong1Δ

(1.National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China; 2.Beijing Novartis Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201210, China)

ObjectiveTo establish the chromogenic substrate method to determine the activity of cytochrome C.MethodsUsed TMB as the chromogenic substrate, reacted at 37 ℃ for 15 min, generated the yellow products, and detected the absorbance at 450 nm.The experimental design method is the 4×4 parallel line quantitative analysis.ResultsThe activities of cytochrome C injection samples have been determined.The linear regression equation was Y=0.9875 X - 1.0221，R2=0.9996.The accuracy and repeatability were 1.1 % and 3.6 %.ConclusionThe chromogenic substrate method was simple operation, sensitive and can be used to determine the activity of cytochrome C.

cytochrome C; chromogenic substrate method; activity; substrate; TMB

刘莉莎，女，硕士，主管药师，研究方向：酶类生化药物质量控制，E-mail：Jzllisha@163.com范慧红，通讯作者，女，博士，研究员，研究方向：生化药物质量研究，E-mail：shenghuayaoshi@126.com。

R719

A

1005-1678(2015)07-0138-03