枸橼酸咖啡因对睡眠呼吸暂停综合症大鼠肺功能、VEGF与胰岛素样生长因子影响研究

王丽晔，刘运秋Δ，耿贺梅，郑丽颖，王瑞霞，修春霞

(河北联合大学附属开滦总医院 呼吸内科，河北 唐山 063000)



枸橼酸咖啡因对睡眠呼吸暂停综合症大鼠肺功能、VEGF与胰岛素样生长因子影响研究

王丽晔1，刘运秋1Δ，耿贺梅1，郑丽颖1，王瑞霞1，修春霞1

(河北联合大学附属开滦总医院 呼吸内科，河北 唐山 063000)

目的 探讨枸橼酸咖啡因对睡眠呼吸暂停综合症大鼠肺功能、血管内皮细胞生长因子(VEGF)与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的影响。方法 选取睡眠呼吸暂停综合症模型Wistar雄性大鼠80只，随机选取20只为正常对照组，其余进行呼吸暂停综合征模型复制，模型复制成功后，随机分为模型组20只，实验组20只和阳性药组20只，实验组予枸橼酸咖啡因注射液5 mg/kg腹腔注射，阳性药组给予氨茶碱3 mg/kg腹腔注射，模型组等量生理盐水腹腔注射，每天1次，连续1周；干预结束后，比较各组大鼠的肺功能相关指标、血清VEGF、IGF-1含量及睡眠呼吸暂停相关指标。结果 与阳性药组比较，实验组大鼠肺功能相关指标明显升高(P<0.05)；血清VEGF水平明显降低(P<0.05)；血清IGF-1水平明显升高(P<0.05)；NREM期及REM期的睡眠呼吸暂停指数明显下降(P<0.05)。结论 枸橼酸咖啡因能够改善睡眠呼吸暂停综合症大鼠的肺功能，降低其血清VEGF水平，促进血清IGF-1的生成，使睡眠呼吸暂停指数降低。

睡眠呼吸暂停综合症；枸橼酸咖啡因；肺功能；VEGF；胰岛素样生长因子

睡眠呼吸暂停综合症全称睡眠呼吸暂停低通气综合症(SAHS)是一种存在潜在致死性的睡眠呼吸系统疾病，以打鼾、睡眠中出现呼吸暂停为主要表现，极易诱发高血压、冠心病、呼吸衰竭等疾病[1]。国外报道其患病率是0.3%～4%，男性高于女性[2]，发病率随年龄的增加而增加，重度未治疗者8年生存率仅为63%，因此早期给予治疗干预显得尤为重要。氨茶碱属于甲基黄嘌呤类药物，对中枢神经有兴奋作用，能降低中枢化学感受器对CO2的刺激阈，增强由于缺氧引起的呼吸兴奋。枸橼酸咖啡因治疗早产儿呼吸暂停，通过降低CO2浓度，兴奋中枢神经系统，加快呼吸频率和每分钟通气量，刺激呼吸中枢，增加肺血流，从而减少呼吸暂停发生的次数。研究表明[3]，枸橼酸咖啡因对原发性的早产儿呼吸暂停有良好的临床疗效，作为抢救措施能够有效减少患儿的病死率，且不良反应较少。但是由于本药引进较晚，目前国内相关实验及临床研究此，本研究对睡眠呼吸暂停综合症大鼠模型进行研究，探讨枸橼酸咖啡因对睡眠呼吸暂停综合症大鼠肺功能、VEGF与胰岛素样生长因子的影响，为枸橼酸咖啡因应用于临床提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取雄性Wistar大鼠(由河北医科大学动物实验室提供，许可证号:130001023)80只，周龄6周，体质量180～220 g。所有大鼠均于室温20～25 ℃，湿度55%～60%，明暗周期为12 h：12 h的环境中适应性饲养1周，投以标准饲料，大鼠自由活动与进食。

1.2 药品与仪器 注射用异戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司，国药准字H31021725)，注射透明质酸钠(上海海研医学生物技术有限公司，国药准字S20030057)，枸橼酸咖啡因注射液[Caffeine Citrate Injection (Peyona)，国药准字H20130109]，氨茶碱(山东新华制药股份有限公司，国药准字H37022906)；泰科电极板E7509(深圳市多乐美途贸易有限公司)，RWD407动物呼吸机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，BUXCO动物肺功能分析系统(美国Buxco)，ELx800全自动酶标仪(美国biotek)。

1.3 方法

1.3.1 造模及实验方法[4]:选取20只大鼠为正常对照组，其余大鼠适应饲养后，采用0.8%戊巴比妥钠溶液进行麻醉，仰卧位，在大鼠颅骨表面植入电极板，连接改造过的睡眠呼吸检测仪，之后暴露口腔，向舌根、咽腭弓和舌腭弓注射透明质酸钠至大鼠出现呼吸暂停，大鼠清醒后进行分笼饲养。注射1%透明质酸钠1 mL后，第4周监测分析大鼠清醒及睡眠状态的呼吸暂停指数(apnea index,AI)和最长呼吸暂停时间(Ltime)，清醒期AI≥7次/h，Ltime≥14 s，睡眠期AI≥15次/h，Ltime≥16 s即为造模成功，本次所选大鼠全部造模成功。将模型大鼠随机分为模型组、实验组和阳性药组各20只。实验组大鼠给予枸橼酸咖啡因注射液5 mg/kg腹腔注射治疗，1天1次，连续1周，阳性组大鼠给予氨茶碱(山东新华制药股份有限公司，国药准字H37022906，生产批号：20021016)3 mg/kg腹腔注射治疗，1天1次，连续1周，模型组大鼠同时期给予等量的生理盐水腹腔注射，连续1周。

1.3.2 肺功能测定:干预后，采用动物肺功能分析系统(美国Buxco)测定各组大鼠的肺功能，计算深吸气量(IC)、最大呼气流速(PEF)、第0.3s用力呼气后的容积(FEV0.3)以及潮气量和每分钟呼气量(VE)。

1.3.3 血清指标检测:于干预后采取大鼠的尾静脉血3 mL，3000 r/min离心20 min后取上清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)法，通过ELx800全自动酶标仪(美国biotek)，测定血清中血管内皮生长因子(VEGF)与胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的含量。

1.3.4 睡眠呼吸暂停情况检测:通过改造过的RWD407动物呼吸机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，记录、分析干预后大鼠在非快速动眼期(NREM期)、快速动眼期(REM期)睡眠呼吸暂停指数(AI)、叹息后呼吸暂停指数(PSAI)以及自发呼吸暂停指数(SPAI)。

2 结果

2.1 干预后各组大鼠的肺功能比较 干预后，实验组与阳性药组大鼠的肺功能均明显改善(P<0.05)，与阳性药组比较，实验组IC 、PEF 、FEV0.3以及VE明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 干预后各组大鼠的肺功能比较±s)Tab.1 Comparison of the lung function before and after the ±s)

*P<0.05，与模型组比较，compared with the model group，#P<0.05，与阳性药组比较，compared with positive drug group

2.2 干预后各组大鼠血清VEGF水平比较 干预后，实验组与阳性药组大鼠的血清VEGF水平均明显改善，与阳性药组比较，实验组血清VEGF水平明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 干预后各组大鼠血清VEGF水平比较Tab.2 Comparison of VEGF of each groups ±s，pg/mL)

*P<0.05，与模型组比较，compared with the model group，#P<0.05，与阳性药组比较，compared with positive drug group

2.3 干预后各组大鼠血清IGF-1水平比较 干预后，实验组和阳性药组大鼠的IGF-1水平均明显改善，与阳性药组比较，实验组IGF-1水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 干预后各组大鼠血清IGF-1水平比较Tab.3 Comparison of IGF-1of each groups ±s，pg/mL)

*P<0.05，与模型组比较，compared with the model group，#P<0.05，与阳性药组比较，compared with positive drug group

2.4 干预后各组大鼠睡眠呼吸暂停情况比较 干预后，实验组和阳性药组大鼠的睡眠呼吸暂停情况均明显好转显著低于模型组(P<0.05)，与阳性药组比较，实验组NREM期及REM期的AI、PSAI、SPAI均较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 干预后各组大鼠睡眠呼吸暂停情况比较±s，次/h)Tab.4 Comparison of rat sleep apnea ±s，times/h)

*P<0.05，与模型组比较，compared with the model group，#P<0.05；与阳性药组比较，compared with positive drug group

3.讨论

目前，我国睡眠睡眠呼吸暂停综合症(SAHS)的发病率为4%左右，由于其打鼾、呼吸暂停、憋醒等临床表现多发生在夜间，很容易被忽视，一旦发现，多已伴有肺心病、呼吸衰竭、冠心病、心率失常等并发症，对患者造成很大痛苦[5]。SAHS的病因尚不明确[6]，目前认为大多数与上呼吸道狭窄有关，肥胖、变应性鼻炎、腭垂过长过粗、鼻息肉等均可使上气道肌肉对低氧和二氧化碳的刺激反应性降低，引起呼吸暂停。研究显示[7]，SAHS使得机体夜间长期处于低通气状态，血样饱和度不足，气道阻塞引起呼吸功能障碍，久之可以使得肺功能下降，引起呼吸衰竭，通气功能受到影响。血管内皮生长因子(VEGF)属于血小板衍生生长因子家族，具有促进血管内皮增殖、调节血管结构、加速血管生成的作用，在正常人体中表达水平较低。VEGF合成及活性主要受到缺氧的调控，资料显示[8]，SAHS导致的肺功能降低，机体处于乏氧状态，能够刺激VEGF及其受体的生成和表达，加速血管增殖与重建。胰岛素生长因子-1(IGF-1)属于胰岛素类多肽，具有促进代谢和组织生长的作用，其合成对氧浓度有依赖性，研究发现[9]，低氧程度增加，血清中IGF-1的水平随之降低，SAHS患者病情越严重，IGF-1水平越低。在本实验中，选取SAHS模型大鼠进行研究，试图探讨枸橼酸咖啡因对SAHS的影响极其作用过程，为枸橼酸咖啡因更好的应用于临床提供理论依据。

当患者从清醒进入睡眠状态时，呼吸中枢对高CO2的反应下降，即CO2刺激的反应阀值升高，如果反应阀值足够高，超过血CO2所能达到的最高水平，即有可能出现呼吸暂停综合征；随着呼吸暂停时间的延长，PaCO2逐渐升高，达到一定水平后，呼吸恢复，患者发生短暂觉醒，中枢神经系统对高CO2反应的阀值随之降低，较高的血CO2水平即引起过度通气，CO2降至较低水平。重新入睡后，再次发生CSA，周而复始，反复循环。氨茶碱属于甲基黄嘌呤类药物，对中枢神经有兴奋作用，能降低中枢化学感受器对CO2的刺激阈，增加呼吸中枢对CO2的敏感性，增强缺氧引起的呼吸兴奋，兴奋吸气神经元，增加呼吸频率。

本研究结果发现，实验组IC 、PEF 、FEV0.3以及VE与阳性药组比较明显升高 (P<0.05)，证实了枸橼酸咖啡因能够改善SAHS大鼠的肺功能。枸橼酸咖啡因是咖啡因的一种，属于甲基黄嘌呤类药物，能够兴奋中枢神经系统，使神经中枢对二氧化碳的敏感性升高，同时能增加呼吸机的收缩力，促进呼吸运动，改善肺功能。曾有研究报道[10]，应用枸橼酸咖啡因和氨茶碱对125例诊断为原发性呼吸暂停的早产儿进行治疗，结果显示枸橼酸咖啡因比氨茶碱具有更好的临床效果，能够提高患儿的肺功能，且具有半衰期长、血浆浓度波动小等特点，不良反应较少，与本研究结果相似。

血清VEGF水平与SAHS的严重程度有关，其过度表达与慢性缺氧关系密切，同时参与心血管并发症的发病过程，通常作为衡量SAHS严重程度与心血管功能状态的指标，有研究称[11]，SAHS患者体内内皮素和氧自由基水平增加，能够促进VEGF水平的表达。本研究结果显示，实验组大鼠的血清VEGF水平与阳性药组比较明显降低(P<0.05)，提示枸橼酸咖啡因能够改善体内缺氧状态，抑制VEGF的过度表达，对心血管功能起到保护作用。

IGF-1是促进合成与代谢的激素，研究显示[12]，其对于心肌、呼吸肌、骨骼肌等多种细胞的凋亡具有抑制作用，但其基因转录表达受氧浓度的影响较大，在SAHS导致的低氧环境下，基因表达受到抑制，血清IGF-1水平随之下降，失去对心肌细胞的保护作用。本研究结果显示，实验组大鼠的血清IGF-1水平与阳性药组比较明显升高(P<0.05)，这可能与枸橼酸咖啡因改善肺功能的作用有关，肺功能得到恢复，体内乏氧情况好转，对IGF-1基因抑制作用减弱，使得血清IGF-1水平升高(P<0.05)，促进DNA、RNA的表达与复制，加速蛋白合成，防止心肌细胞凋亡。

本研究结果显示，实验组NREM期及REM期的AI、PSAI、SPAI与阳性药组比较均明显下降(P<0.05)，提示枸橼酸咖啡因能够降低大鼠睡眠中呼吸暂停发生的频率，改善SAHS病情。枸橼酸咖啡因含有50%的咖啡因成分，相对于其他黄嘌呤类中枢兴奋药，具有安全范围宽、脂溶性高、容易吸收、生物利用度高、不良反应小的优点，更适于临床应用。

本实验通过对80例SAHS模型大鼠肺功能相关指标、血清VEGF、IGF-1含量及睡眠呼吸暂停相关指标检测结果进行分析，证实了枸橼酸咖啡因具有改善睡眠呼吸暂停综合症大鼠的肺功能，降低其血清VEGF水平，促进血清IGF-1的生成，使睡眠呼吸暂停指数降低的作用。在下一步研究中，将进行分子机制方面研究，为本实验所反映的现象做出进一步论证和分析。

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(编校：谭玲)

Effect of caffeine citrate on pulmonary function, VEGF and insulin-like growth factor in sleep apnea hypopnea syndrome rats

WANG Li-ye1, LIU Yun-qiu1Δ, GENG He-mei1, ZHENG Li-ying1, WANG Rui-xia1, XIU Chun-xia1

(Department of Internal Medicine Respiratory, Kailuan General Hospital of Hebei United University, Tangshan 063000, China)

ObjectiveTo analysis the effect of caffeine citrate on pulmonary function, vascular endothelial growth factor (VEGF)and insulin like growth factor -1 (IGF-1) in the apnea syndrome rats.Methods80 male Wistar rats were selected, 20 were randomly selected to be the control group, the rest of the rats were replicated of apnea syndrome model.The rats were randomly divided into model group, experiment group and positive drug group, 20 of each group.The experimental group was given caffeine citrate injection of 5 mg/kg intraperitoneal injection, the positive drug group was given intraperitoneal injection of aminophylline 3 mg/kg, the model group was given intraperitoneal injection of normal saline, once a day, continuously for 1 week.Pulmonary function, serum VEGF, IGF-1 levels and sleep apnea were compared after the experiment.ResultsCompared with the positive drug group, the related indexes of pulmonary function of the experimental group increased significantly (P<0.05).Serum VEGF levels decreased significantly (P<0.05).The serum IGF-1 level increased significantly (P<0.05).The sleep apnea index decreased significantly during the period of NREM and REM.(P<0.05).ConclusionCaffeine citrate can improve apnea syndrome rats lung function, reduce the serum VEGF level, promote the formation of serum IGF-1, reduce the sleep apnea index.

sleep apnea hypopnea syndrome; caffeine citrate; pulmonary function; VEGF; insulin-like growth factor

王丽晔，女，硕士，副主任医师，研究方向：呼吸介入，E-mail：lhwliyep@126.com;：刘运秋，通讯作者,男，硕士，主任医师，研究方向：呼吸介入，E-mail：liu236191769@126.com。

R543

A

1005-1678(2015)07-0047-04