高糖对血管内皮功能的影响研究

周利婷，张四喜，曲晓宇，宋燕青

(吉林大学第一医院 药学部，吉林 长春 130000)



高糖对血管内皮功能的影响研究

周利婷，张四喜，曲晓宇，宋燕青

(吉林大学第一医院 药学部，吉林 长春 130000)

目的 探究高糖对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells，HUVECs)内皮功能的影响。方法 体外培养HUVECs并分为正常对照组(NG)、低浓度葡萄糖组(LG)、中浓度葡萄糖组(MG)和高浓度葡萄糖组(HG)，各组培养液中葡萄糖的终浓度分别为5.5、10 、20、30 mmol/L。分别在孵育0、24、48 h后采用MTT法测定细胞活力；Griess法检测培养液中NO分泌量；收集细胞，western blot法测定内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达。结果 培养24 h后，与同时间点NG组相比，LG组和MG组细胞活力及 NO含量均显著降低(P<0.05)，但eNOS的表达无显著差异；HG组细胞活力、NO含量及eNOS的表达均显著下降(P<0.01)。培养48 h后，与同时间点NG组相比，LG和MG eNOS的表达分别显著下降了11.91%(P<0.05)和25.72%(P<0.01)；而HG组细胞活力显著下降(P<0.05)，NO含量显著下降(P<0.01)，eNOS的表达下降了34.50%(P<0.01)。细胞培养48 h内，NG、LG和MG组的细胞活力呈上升趋势，而HG的细胞活力呈显著下降趋势。结论 高糖可显著影响HUVECs的细胞活力，且在高糖环境下，eNOS表达受到抑制，从而导致NO生成量减少，造成内皮细胞功能障碍。

高糖；人脐静脉内皮细胞；内皮细胞功能障碍；内皮型一氧化氮合酶

心脑血管疾病死亡率居我国所有疾病死亡人数之首[1]。伴糖尿病的冠心病患者较不伴糖尿病的患者具有更高冠状动脉疾病的发病率、致残率和病死率[2-3]。研究表明，心脑血管疾病和糖尿病具有共同的病理基础：血管内皮功能障碍[4]。而一氧化氮(NO)生物利用度低是造成内皮功能障碍的一个重要因素[5]。正常情况下，血管系统中的NO主要源于内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，具有强烈的舒血管作用，同时具有抑制血小板在血管内皮黏附和聚集、抑制平滑肌细胞增殖和抑制内皮-单核细胞黏附的作用[6-7]。高血糖环境下，血管内皮细胞发生病变，其分泌活性随之改变[4]。因此，本实验采用不同浓度的葡萄糖诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vascular endothelial cells, HUVECs)内皮功能损伤，通过测定细胞活力、NO分泌量及eNOS表达量，探究高糖诱导的内皮细胞功能障碍与eNOS相关的损伤机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验试剂与仪器 原代人脐静脉内皮细胞、内皮细胞培养基及胰蛋白酶/EDTA均购自美国ScienCell公司；D-(+)-葡萄糖(含量98%)购自北京百灵威科技有限公司；eNOS抗体购自Santa Cruz，GAPDH购自杭州贤至；辣根酶标记山羊抗兔IgG及辣根酶标记山羊抗小鼠IgG均购自北京中杉金桥；NO检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。预染蛋白Marker购自MBI公司，ECL发光液购自Thermo公司。酶标仪(Biotek)；电泳仪(DYCZ-24DN，北京六一仪器厂)；转膜仪(DYCZ-40D，北京六一仪器厂)。

1.2 HUVEC培养及给药 取生长状态良好的3-5代HUVECs均匀接种于6孔板，分为以下4组：①正常对照组(NG)，正常生长于内皮细胞培养基，培养液葡萄糖浓度为5.5 mmol/L；②低浓度葡萄糖组(LG)，培养液中葡萄糖终浓度为10 mmol/L；③中浓度葡萄糖组(MG)，培养液中葡萄糖终浓度为20 mmol/L；④高浓度葡萄糖组(HG)，培养液中葡萄糖终浓度为30 mmol/L。每组重复数为6，培养48 h。

1.3 MTT法检测细胞活力 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度并接种于96孔板，5% CO2，37 ℃孵育，至细胞单层铺满孔底，加入浓度梯度的葡萄糖溶液。继续孵育16～48 h，倒置显微镜下观察。每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，继续培养4 h后，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μL二甲基亚砜，低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值(OD值)。各组细胞存活率=OD实验组/ODNG组×100%。

1.4 Griess法检测NO含量 按照其使用说明书操作：①取出Griess Reagent I和II，使回复室温。②用待测样品所用溶液稀释标准品(1～100 μM)。③按50 μL/孔，在96孔板中加入标准品及样品。④按50 μL/孔，在各孔中加入室温Griess Reagent I。⑤按50 μL/孔，各孔中加入室温Griess Reagent II。⑥540 nm 测定吸光度。

1.5 免疫印迹实验检测eNOS表达 抽提细胞样品，PBS缓冲液清洗3次，然后加入0.3 mL RIPA裂解液。充分裂解后14000 g，20 min 4 ℃。取上清蛋白变性，于-80 ℃保存待用。

将保存的蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳-湿法转膜-抗体孵育-曝光和显影，得到的图片经凝胶图像分析成像系统进行扫描分析，得出条带灰度值。用目标条带除以内参GAPDH蛋白条带的灰度值即为目标蛋白的相对表达量

2 结果

2.1 MTT法检测高糖对细胞活力的影响 由表1可知，细胞培养24 h后，与同时间点NG组相比， LG和MG组的细胞活力均显著下降(P<0.05)，而HG组细胞活力下降最显著(P<0.01)；细胞培养48 h后，NG组细胞活力显著增加(P<0.05)，与NG组相比，LG、MG组细胞活力没有显著差异，而HG组细胞活力均显著下降(P<0.01)。

表1 高糖对细胞活力的影响Tab.

*P<0.05，与同时间点NG组比较，compared with normal group at same time point

2.2 高糖对HUVECs中NO含量的影响 由图1可知，细胞培养24 h后，与同时间点NG组相比， LG组的NO的含量均显著下降(P<0.05)，MG和HG组NO含量分别显著下降了25.82%和30.59%(P<0.01)；细胞培养48 h后，与NG组48 h相比，LG组NO分泌量无显著差异，MG和HG组NO含量分别显著下降了24.96和52.63%(P<0.01)。

图1 高糖对NO含量的影响(n=6)*P<0.05，**P<0.01，与同时间点NG组相比Fig.1 Effect of high glucose on the content of NO(n=6)* P<0.05,**P<0.01, compared with normal group at same time point

2.3 高糖对HUVECs eNOS表达的影响 由图2可知，细胞培养24 h后，与NG组相比，HG组eNOS的表达显著下降(P<0.01)，而LG和MG组差异无统计学意义；细胞培养48 h后，与NG组相比，LG组eNOS的表达显著下降了11.91%(P<0.05)，MG和HG组eNOS的表达分别下降了25.72%和34.50%(P<0.01)。

图2 高糖对eNOS表达的影响* P<0.05，**P<0.01，与同时间点NG组相比A.HUVECs培养24和48 h后各组目的蛋白eNOS和内参蛋白GAPDH的免疫印迹条带；B.HUVECs培养24和48 h后各组eNOS的表达量变化Fig.2 Effect of high glucose on the expression of eNOS* P<0.05, **P<0.01,compared with normal group at same time pointA.The representative western immunoblots of eNOS and GAPDH at 24 and 48 h time points after HUVECs were cultured；B.The statistical analysis of mean relation protein expression of eNOS at 24 and 48 h time points after HUVECs were cultured

3 讨论

研究表明，高糖是导致血管内皮功能障碍的主要因素之一，血管内皮细胞功能障碍不但是动脉粥样硬化致心血管疾病的主要原因，亦是糖尿病血管并发症的使动环节[8-9]。因此，研究高糖状态下内皮细胞的功能变化，对深入探究心脑血管疾病及糖尿病动脉粥样硬化的机理具有十分重要的意义。正常人的空腹血糖维持在3.3～6.1 mmol/L，故本课题以5.5 mmol/L为正常对照组，比较4组不同葡萄糖浓度影响下的细胞活力、NO生成量和HUVECs的eNOS的表达。

在高糖培养HUVECs 48 h内，30 mmol/L 高糖组与同时间点的5.5 mmol/L的正常对照组相比，其细胞活力显著下降，并且eNOS的表达量减少，NO的生成量显著降低。NO是由内皮细胞产生的有效的血管扩张剂，在保护内皮细胞功能上承担着至关重要的作用。NO可抑制血管平滑肌的增殖，还可以抑制血小板的凝集，以及抑制白细胞黏附于血管壁高血糖在体外降低内皮源性NO的产生[10-11]。近年来研究表明，糖尿病患者血管内皮细胞功能障碍是由 eNOS脱偶联引起的，从而使eNOS介导产生超氧阴离子而非 NO，减弱了内皮细胞eNOS 的活性其释放 NO 的能力[12-14]。

在高糖培养HUVEC 48 h内，与同时间点的NG组相比，LG和MG组NO生成量及eNOS的表达量均显著降低， 但是其细胞活力与NG组呈相同趋势，均显著增加，三组间差异无统计学意义。因此，可知，高浓度葡萄糖通过降低eNOS的表达量从而使NO的分泌量减少，引起内皮细胞功能失调。

本实验阐明在不同浓度葡萄糖影响下，HUVECs的细胞活力发生显著变化，且在高糖环境下，HUVECs的eNOS表达受到抑制，从而导致NO生成量减少，可能是高糖造成血管内皮功能障碍的原因之一，为临床上解释高血糖患者心血管疾病发病率高的现象提供理论基础，但其相关分子机制仍有待进一步研究。

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(编校：谭玲)

Effect of high glucose on endothelial function

ZHOU Li-ting, ZHANG Si-xi, QU Xiao-yu, SONG Yan-qing

(Department of Pharmacy, First Hospital of Jilin University, Changchun 130000, China)

ObjectiveTo investigate effect of high glucose on the function of endothelial and the underlying mechanisms in human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs).MethodsThe experiment was divided into 4 groups: normal group (NG), low dose group (LG), middle dose group (MG) and high dose group (HG).The concentration of glucose in the culture medium was 5.5, 10, 20, 30 mmol/L in the 4 groups, respectively.The HUVECs was cultured for 0, 24, 48 h.At different time point, the cell viability were measured by MTT.The secretary content of nitric oxide (NO) in the supernatant were detected using test kit.The extraction of protein were extracted for Western blot analysis to detect the expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS).ResultsCompared with normal group at same time point (cultured for 24 h), the cell viability and the content of NO were significantly decreased in LG, MG(P<0.05).The expression of eNOS in HG were markedly reduced (P<0.01).Compared with normal group at same time point (cultured for 48 h), the cell viability decreased significantly in HG (P<0.05).The expression of eNOS were markedly decreased 11.91, 25.72 and 34.50% in LG, MG and HG, respectively.A rising trend of cell viability were found in NG, LG and MG, but a descending trend were found in HG within 48 h.ConclusionThe cell viability were significantly affected by high glucose.The endothelial dysfunction induced by high glucose may be associated with the reduction of eNOS and NO production.

high glucose; vascular endothelial dysfunction; endothelial nitric oxide synthase

周利婷,女，硕士，主管药师，研究方向：药理学，E-mail：343383824@qq.com。

R587.1

A

1005-1678(2015)07-0029-03