利用低氧/厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨

储倩雯，李伟秋，鲁诗史，黄丹梅，张艳美Δ

(1.汕头大学医学院 药理教研室，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院 分析细胞实验室，广东 汕头 515041；3. 汕头大学医学院第一附属医院 药剂科，广东 汕头 515041)



利用低氧/厌氧工作站建立H9c2细胞缺氧复氧模型的探讨

储倩雯1，李伟秋2，鲁诗史3，黄丹梅1，张艳美1Δ

(1.汕头大学医学院 药理教研室，广东 汕头 515041；2.汕头大学医学院 分析细胞实验室，广东 汕头 515041；3. 汕头大学医学院第一附属医院 药剂科，广东 汕头 515041)

目的 利用低氧/厌氧工作站，结合不同的缺氧条件，探讨建立H9c2细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation， H/R)模型的最佳方法。方法 缺氧时将H9c2细胞置于低氧/厌氧工作站中，分别以完全培养基，无糖培养基和酸性缺氧液培养1、2、4、6、8 h，缺氧后换用完全培养基于培养箱中按常规条件培养1 h。流式细胞仪测定细胞内活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量，噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)法检测细胞生存率，倒置显微镜下观察H9c2细胞形态变化。结果 与对照组比较，缺氧时以完全培养基和无糖培养基处理的H9c2细胞H/R后，细胞内ROS含量和细胞存活率随缺氧时间延长无明显改变，且倒置显微镜下未观察到明显的形态变化。缺氧时以酸性缺氧液处理的H9c2细胞，随H/R时程的延长，细胞内ROS含量不断增加(P<0.01)，且细胞存活率逐渐降低(P<0.01)，倒置显微镜下观察到细胞H:1 h/R:1 h后开始出现部分细胞皱缩，少量坏死细胞漂浮，随时间延长损伤加重；缺氧8 h后，细胞皱缩成圆形，大量坏死细胞漂浮，复氧1 h后可见细胞膜表面不平滑，复氧液中仍有少量坏死细胞漂浮。结论 采用低氧/厌氧工作站，并结合酸性缺氧液，可成功建立重现性非常好的H9c2细胞H/R模型。

低氧/厌氧工作站；H9c2细胞；缺氧复氧模型

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion， I/R)损伤是心脏缺血性疾病和心脏外科手术后常见的一种病理生理现象。体外心肌细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation， H/R)模型一直被广泛应用于心脏I/R损伤的研究，对于探讨I/R损伤的分子机制具有重要的意义。但国内外建立的H/R细胞模型没有统一的标准，目前常用的方法主要有：混合气体培养法、模拟缺氧/再灌注液培养法、氮气饱和培养基法、液体石蜡覆盖法等单纯物理性模型[1]。而化学模型建立方法主要是利用氧清除剂二亚硫酸钠和氯化钴[2-3]。这些方法都存在一些缺点，如操作复杂，无法准确地控制缺氧过程的氧分压，缺氧条件的重复性差等。探寻一个稳定，可靠，便于操作的H/R损伤的细胞模型，将为研究心脏I/R损伤提供一个可靠的平台。来源于大鼠胚胎期心室的H9c2细胞株被用于本实验中，该细胞株保持着心肌细胞的多种特性，被广泛应用于心脏疾病的体外研究中。本研究利用新购置的低氧/厌氧工作站，结合不同的缺氧培养条件，以心肌I/R最重要的病理生理改变之一—活性氧(reactive oxygen species，ROS)[4]作为评判模型成功与否的标准，探讨建立H9c2细胞H/R模型的最佳方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 H9c2细胞 (ATCC公司，美国)、胎牛血清(Biowest公司，法国)、DMEM培养基(Gibco公司，美国)，2′，7′-二氯荧光乙酰乙酸盐(DCFH-DA)(Sigma公司，美国)，噻唑蓝(MTT)(Amersco公司，美国)。其余试剂均为国产分析纯。低氧/厌氧工作站Invivo2 400(Ruskinn公司，英国)，CO2培养箱(Sanyo公司，日本)，倒置相差显微镜(Nilkon公司，日本)，Accuri C6流式细胞仪(Becton Dickinson公司，美国)，全波长酶标仪(Molecular Devices公司，美国)，低温高速离心机(Heraeus公司，德国)。

1.2 方法

1.2.1 H9c2细胞培养：将H9c2细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基的培养皿中(同时含有100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)，置于37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培养，1～2天换液。当细胞长至80%～90%时消化传代。

1.2.2 实验分组及H/R模型建立：将H9c2细胞随机分为对照组、完全培养基处理H/R模型组、无糖培养基处理H/R模型组以及酸性缺氧液处理H/R模型组，除对照组外，各不同缺氧液处理的H/R模型组分别设定5个H/R时程(H:1 h/R:1 h，H:2 h/R:1 h，H:4 h/R:1 h，H:6 h/R:1 h，H:8 h/R:1 h)。

缺氧时各H/R组分别换用完全培养基、无糖培养基和酸性缺氧液，置于低氧/厌氧工作站中(1%O2，5%CO2，94%N2，37 ℃)，缺氧结束后均换用完全培养基置于培养箱中复氧培养1 h。对照组则于复氧前换用完全培养基培养1 h。实验过程中使用的酸性缺氧液配方为NaCl：8.0064 g，KCl：0.8946 g，MgCl2：0.0467 g，CaCl2：0.0999 g，HEPES：0.953 g，Na lactate：3.735 mL，加水至1000 mL，调节pH至6.2[5]。在超净台内用0.22 μm微孔滤膜过滤。

1.2.3 MTT法检测细胞存活率：将H9c2细胞按1×104个/孔的密度接种于96板中，8孔/组，取平均值作为一次实验结果。培养24 h后，按上述实验分组及模型建立方法处理细胞。待复氧结束后，吸干培养基，每孔加入200 μL含10%MTT(5 mg/mL)的无血清DMEM培养基，置于37 ℃，5%CO2的培养箱中避光孵育4 h。吸干培养基，每孔加入200 μL的DMSO，震摇15 min，使结晶充分溶解，酶标仪于490 nm波长处检测各组吸光度值。实验重复4次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞内ROS浓度：将H9c2细胞接种于6 cm培养皿中，待细胞长至70%～80%时，按上述实验分组及模型建立方法处理细胞。复氧结束后，倒掉培养基，用PBS洗2次，每皿加0.125%胰酶消化1 min，弃胰酶，各加1 mL含血清DMEM中止消化，收集细胞于1.5 mL 离心管中；离心，弃上清，用无血清DMEM清洗一次，各加入1 mL含10 μM DCFH-DA荧光探针的无血清DMEM培养基。于培养箱中(37 ℃，5%CO2)避光孵育30 min，每5 min上下颠倒震荡一次。用PBS清洗3次，每管加入500 μL PBS重悬。于488 nm激发波长，525 nm发射波长条件下，用流式细胞仪检测各组荧光强度。计数10000个细胞，以其平均荧光强度(mean flourscence indensity，MFI)反映各组细胞内ROS水平。实验重复4次。

1.2.5 倒置荧光显微镜下观察细胞形态变化：待细胞长至70%～80%时，按上述实验分组及模型建立方法处理细胞。分别在缺氧和复氧结束后，倒置显微镜下观测细胞形态变化，分别记录对照组，完全培养基、无糖培养基以及酸性缺氧液处理下的细胞 H:8 h/R:1 h组的形态变化。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞存活率 以对照组细胞存活率为100%，完全培养基和无糖培养基处理的各时程H/R组细胞存活率差异无统计学意义。酸性缺氧液处理的H/R模型组的细胞存活率随时间的延长逐渐下降，差异具有统计学意义(P<0.0001)。见表1。

表1 MTT法测定不同缺氧液处理的细胞的存活率变化Tab.1 The cell viability was detected by MTT assay under different hypoxic solution(±s，n=4)

*P<0.01，与对照相比，compared with control group；#P<0.05，与H:1 h/R:1 h相比，compared with H:1 h/R:1 h group；ΔP<0.05，与H:2 h/R:1 h相比，compared with H:2 h/R:1 h group

2.2 流式细胞仪测定细胞内ROS水平 各组细胞内ROS水平变化如表2所示。以对照组ROS的MFI为1，完全培养基处理的各时程H/R组细胞内ROS的MFI差异无统计学意义。以对照组ROS的MFI为1，无糖培养基处理的各时程H/R组细胞H:4 h/R:1 h 与H:1 h/R:1 h 相比，差异有统计学意义(P<0.05)，其余各组间差异无统计学意义。H:4 h/R:1 h与H:1 h/R:1 h相比，ROS水平增加约1.50倍，差异有统计学意义(P<0.05)，其余各组间差异无统计学意义。以对照组ROS的MFI为1，各酸性缺氧液处理的H/R模型组的MFI与对照组相比，随时间延长逐渐增加，即细胞内ROS水平显著升高(P<0.0001)，H:4/R:1 h起，细胞内ROS水平已是对照组的约2.57倍，且随时间延长，呈递增趋势，H:8 h/R:1 h后细胞内ROS水平是对照组的3.31倍。说明低氧/厌氧工作站结合使用酸性缺氧液可使细胞内ROS水平显著增加。见表2，图2。

表2 流式细胞仪法测定不同缺氧液处理的细胞内ROS水平变化Tab. 2 The level of ROS was measured by flow cytometry under different hypoxic solution (±s，n=4)

*P<0.01，与对照相比，compared with control group；#P<0.05，与H:1 h/R:1 h相比，compared with H:1 h/R:1 h group；ΔP<0.05，与H:2 h/R:1 h相比，compared with H:2 h/R:1 h group

图2 酸性缺氧液处理的细胞内 ROS水平变化的流式细胞仪原图Fig.2 ROS level detected by flow cytometry under acidic hypoxic solution

2.3 倒置荧光显微下观察细胞形态变化 对照组细胞，呈梭形，折光率好，细胞膜表面光滑。缺氧时以完全培养基和无糖培养基处理的细胞H:8 h/R:1 h后，细胞形态未见明显改变。以酸性缺氧液处理的细胞缺氧1 h后，部分细胞皱缩，体积变小，有少量坏死细胞漂浮，换复氧液的过程中漂浮的坏死细胞随缺氧液一起被弃去，复氧1 h后，又见少量坏死细胞漂浮。随着缺氧的时间延长，皱缩的细胞、漂浮的坏死细胞逐渐增多。缺氧8 h后，可见大部分细胞均皱缩成圆形，复氧1 h后可见细胞体积相对于缺氧前更小，部分坏死细胞漂浮，细胞膜表面不光滑。见图3。

图3 倒置荧光显微镜下观察细胞H/R后形态变化(×100)A：对照组，B：完全培养基处理下的细胞H:8 h/R:1 h组，C：无糖培养基处理下的细胞H:8 h/R:1 h组，D：酸性缺氧液处理下的细胞 H:8 h/R:1 h组Fig.3 The cellular morphology under inverted microscope after H/R(×100)A：control group，B：H:8 h/R:1 h group treated by complete medium，C：H:8 h/R:1 h group treated by glucose-free DMEM，D：H:8 h/R:1 h group treated by acidic hypoxic solution

3 讨论

低氧/厌氧工作站是本实验室新近购置的一台贵重仪器，其可以精确控制氧分压，精确度达0.1%，同时可准确控制二氧化碳浓度、温度、湿度、pH值等参数，且操作过程简单。在心肌I/R的体外研究中，大多使用自制缺氧盒[6]，厌氧袋[7]等，利用其构建细胞H/R模型时O2浓度，CO2浓度难以精确控制，低氧/厌氧工作站可以解决上述问题，降低裸手操作过程中造成的实验误差，使H/R模型更加稳定。由于低氧/厌氧工作站更广泛应用于为厌氧菌提供厌氧气体环境，利用该设备制作H/R模型时，是否需要配合其他实验条件，尚不清楚。

I/R的机制目前尚未完全阐明，多数学者认为I/R发生的基础是能量代谢障碍[8]。在构建H/R损伤模型时常常采用断氧及断糖两种方式，后者包括使用无糖无血清培养基[9]、无糖Hanks液[10]，缺血缓冲液[11]等。研究表明，细胞内的糖代谢途径很大程度上受供氧的影响，缺氧时，细胞内进行糖酵解生成乳酸，导致酸中毒。缺血后细胞外钾离子积聚，Ferrier的研究显示心肌梗死阶段细胞外平均钾离子浓度水平在10 mM左右[12]。本研究中的酸性缺氧液的配制综合了以上因素，加入乳酸，调pH至6.2，提供一个酸性环境，另外，使用12 mM KCl，为细胞提供一个高钾的环境[13]，更真实地模拟在体组织细胞I/R时的微环境。

体内的I/R并非单一的病理损伤，是多种机制参与的复合过程。本实验选用完全培养基、无糖培养基和酸性缺氧液作为缺氧液，配合低氧/厌氧工作站，探讨建立H/R模型的最佳方法。研究表明，I/R或H/R过程中会伴随着大量自由基的产生，生成的自由基会经过多种途径诱导细胞凋亡或坏死[14]。而作为最主要的自由基之一-ROS是目前公认的I/R损伤的一个重要的病理生理改变[15]。故本研究在确定H/R损伤模型是否构建成功时，选用ROS浓度是否激增作为评判指标之一。研究发现在不同H/R时程下，缺氧时以完全培养基处理的H9c2细胞，复氧结束后ROS水平无差别，以无糖培养基处理的H9c2细胞，在设定的缺氧时程内，ROS浓度最高仅约为对照组的1.5倍，而以酸性缺氧液处理的H9c2细胞，ROS水平随缺氧时间的延长而不断增加，H:8 h/R:1 h组ROS浓度为对照组的3.31倍。且细胞存活率的实验结果显示，以完全培养基以及无糖培养基处理的H9c2细胞，H/R后细胞存活率无明显下降，而以酸性缺氧液处理的H9c2细胞，随缺氧时程的延长，细胞存活率不断下降，H:1 h/R:1 h组细胞存活率约为77%，在H:8 h/R:1 h后细胞存活率约为40%，以上结果表明低氧/厌氧工作站结合酸性缺氧液能建立重现性非常好的H9c2细胞H/R模型。

[1] 关欣，李应东.细胞缺氧复氧模型建立方法的研究进展[J]. 医学综述，2008，14(18)：2737-2739.

[2] 余微，许波，彭彦，等.氧耗剂致乳鼠心肌缺氧/复氧模型的建立[J].时珍国医国药，2010，21(7)：1660-1661.

[3] 权晶晶，凌均棨. 二氯化钴在体外细胞缺氧研究中的应用[J].国际口腔医学杂志，2009，36(4)：455-458.

[4] Murphy E, Steenbergen C. Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury [J]. Physiol Rev, 2008, 88(2):581-609.

[5] Wang B, Zhong S, Zheng F, et al.N-n-butyl haloperidol iodide protects cardiomy- ocytes against hypoxiareoxygenation injury by inhibiting autophagy[J].Oncotarget, 2015, 6(28):24709-24721.

[6] Zhang Y, Shi G, Zheng J, et al.The protective effects of N-n-butyl haloperidol iodide on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats by inhibiting Egr-1 overexpression[J].Cell Physiol Biochem, 2007, 20(5):639-648.

[7] 陈俭琴，房晓祎，詹友芹，等.建立新生大鼠心肌细胞缺氧复氧模型[J].汕头大学医学院学报, 2013, 26(2):69-72.

[8] Wu Y, Zhu W, Li YH, et al.Aspirin and Age Related Macular Degeneration; the Possible Relationship[J].Med Hypothesis Discov Innov Ophthalmol, 2013, 2(3):59-68.

[9] Cho S, Cho M, Kim J, et al.Syringaresinol protects against hypoxia reoxygena- tion-induced cardiomyocytes injury and death by destabilization of HIF-1α in a FOXO3-dependent mechanism[J].Oncotarget, 2015, 6(1):43-55.

[10] Wang J, Hong Z, Zeng C, et al.NADPH oxidase 4 promotes cardiac micro vascular angiogenesis after hypoxia/reoxygenation in vitro[J].Free Radic Biol Med, 2014, 69:278-288.

[11] Yang Y, Duan WX, Jin ZX, et al.JAK2STAT3 activation by melatonin attenuates the mitochondrial oxidative damage induced by myocardial ischemiareperfusion injury[J].J Pineal Res, 2013, 55(3):275-286.

[12] Ferrier GR, Moffat MP, Lukas A.Possible Mechanisms of Ventricular Arrhythm- ias Elicited by Ischemia followed by Reperfusion[J].Circulation Research, 1985, 56(2):184-194.

[13] Jonassen AK, Brar BK, MJ?S OD, et al.Insulin administered at reoxygenation exerts a cardioprotective effect in myocytes by a possible anti-apoptotic mechanism[J].J Mol Cell Cardiol, 2000, 32(5):757-764.

[14] Wang AL, Niu Q, Shi N, et al.Glutamine ameliorates intestinal ischemia -reperfusion Injury in rats by activating the Nrf2Are signaling pathway[J].Int J Clin Exp Pathol, 2015, 8(7):7896-7904.

[15] Kumar D, Jugdutt BI.Apoptosis and oxidants in the heart[J].J Lab Clin Med, 2003, 142(5):288-297

(编校：谭玲)

Establishment of a hypoxia/reoxygenation model of H9c2 cell using hypoxia/anoxic workstation

CHU Qian-wen1, LI Wei-qiu2, LU Shi-shi3, HUANG Dan-mei1, ZHANG Yan-mei1Δ

(1.Department of Pharmacy, Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China; 2.Analytical Cytology Laboratory, Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China; 3.Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China)

ObjectiveTo investigate optimal method of establishing hypoxia/reoxygenation(H/R) model of H9c2 cell by using hypoxia/anoxic workstation under different conditions in hypoxia.MethodsH9c2 cell was placed into hypoxia/anoxic workstation and simultaneously cultured with complete medium, glucose-free DMEM and acidic hypoxic solution for 1,2,4,6 and 8 h respectively, and then reoxygenated with complete medium for 1 h in normoxic incubator. The level of ROS was measured by flow cytometry. The cell viability was detected by MTT assay. The cellular morphology was observed by inverted microscope.ResultsWith the extension of cell hypoxia time, there were no significant differences in the ROS level and cell viability in complete medium- and glucose-free DMEM-treated H/R groups compared with control group(P<0.05). There was no obvious morphologic change observed with inverted microscope, either. Nevertheless, when H9c2 cells were treated with acidic hypoxic solution in hypoxia, the ROS level continuously increased and the cell viability decreased with the extension of cell hypoxia time(P<0.01). Since H:1 h/R:1 h, some of the cells shrunk and a few necrotic cells floated in the media under the inverted microscope, and the damage was aggravated with the extension of hypoxia time. After the cells were exposed in hypoxia for 8 h, they wrinkled to be round and a large number of floating necrotic cells were observed. When the cells were reoxygenated for 1 h, the cytomembrane was not smooth and there were still a few necrotic cells floating in culture dish.ConclusionThe H9c2 cell H/R model with good repeatability can be established successfully by using hypoxia/anoxic workstation combining with acidic hypoxic solution.

hypoxia/anoxic workstation; H9c2 cell; hypoxia/reoxygenation model

国家自然科学基金项目(81473215和81072633)；广东省自然科学基金项目(2015A030313448)；中央财政支持地方高校发展专项资金

储倩雯，女，硕士在读，研究方向：心血管药理，E-mail:1521105227@qq.com；张艳美，通信作者，女，博士，教授，研究方向：心血管药理，E-mail：ymzhang@stu.edu.cn。

R363

A

1005-1678(2015)11-0011-04