反相高效液相色谱法测定舒肺合剂中甘草酸铵的含量

吴雪丹，计燕萍，杜静，傅应华Δ

(1.象山县第一人民医院 药剂科，浙江 象山 315700；2.嘉兴学院 医学院药学系，浙江 嘉兴 314001；3. 杭州市红十字会医院 药剂科，浙江 杭州 310009)



反相高效液相色谱法测定舒肺合剂中甘草酸铵的含量

吴雪丹1，计燕萍2，杜静3，傅应华2Δ

(1.象山县第一人民医院 药剂科，浙江 象山 315700；2.嘉兴学院 医学院药学系，浙江 嘉兴 314001；3. 杭州市红十字会医院 药剂科，浙江 杭州 310009)

目的 建立反相高效液相色谱法测定舒肺合剂中甘草酸铵含量的方法。方法 以Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)为色谱柱，乙腈-0.0025 mol/L庚烷磺酸钠液-0.05 mol/L 磷酸二氢钾液(20:45:45) (用20%氢氧化钠液调节pH值为7.2±0.05)为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长250 nm，进样量10 μL，柱温30 ℃。结果 甘草酸铵与相邻组分峰分离良好，阴性样品无干扰。甘草酸铵浓度在23.6～118.1 μg /mL之间与峰面积呈良好线性关系，回归方程Y=0.1133X-0.00110，r=0.999 8，加样回收率(n=6 )为97.8%，RSD=0.88%。3批舒肺合剂样品测定甘草酸铵含量范围在0.2532～0.2865 mg/mL之间，平均为0.2721 mg/mL。结论 本法操作简便、准确，可作为舒肺合剂的含量测定方法。

反相高效液相色谱法；甘草酸铵；舒肺合剂；含量测定

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种全身系统受损的自身免疫性疾病，因体内有大量致病性自身抗体和免疫复合物而造成组织损伤[1]，目前尚无专用于治疗“红斑狼疮”的有效药物。杭州市红十会医院(浙江省中西医结合医院)一直致力于从肺论治降低系统性红斑狼疮抗菌药物用量的临床研究课题，自2002年开始，拟定了疗效确切、毒副作用小、纯中药的润肺和舒肺医院协定处方，结合化学药对SLE患者进行治疗，在减少疾病复发、糖皮质激素和免疫抑制剂的毒副作用及降低SLE患者感染发生率方面取得很好的疗效。舒肺合剂处方由桂枝、桔梗、甘草、天花粉等6味中药组成，对治疗活动期的SLE患者，以清透肺热为主，辅以凉血解毒功能[2]。由于原制剂质量标准无含量测定项目，为了提高本品质量，需要增订含量测定项目。本文依据该制剂的组方特点，方中甘草是君药之一，甘草酸铵是甘草中含量较高的有效成份[3]，可用甘草酸铵作为质控指标。有关甘草酸铵的含量测定方法主要有高效液相色谱法[4-11]。本文研究拟建立反相高效液相色谱法测定舒肺合剂中甘草酸铵含量的方法，以期为甘草酸铵含量测定的方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 高效液相色谱仪由P680四元低压梯度泵、UVD170U紫外-可见检测器、ASI-100自动进样器、Chromeleon色谱数据工作站组成(美国Dionex公司)；XS105DU型电子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)；USC502型超声波清洗器(上海波龙电子设备有限公司，工作频率：56 kHz，功率160 W)；Mili-Q超纯水器(美国密理搏公司)。

甘草酸铵对照品(批号：110731-201317，供含量测定用，含量92.6%)，购自中国食品药品检定研究院；舒肺合剂三批(自制)，规格500 mL(每100 mL相当于甘草3 g)，批号分别为20150121，20150122，20150123；缺甘草的阴性样品一批(自制)，批号：20150121；乙腈为色谱纯(德国Merck公司)，其余试剂均为国产分析纯，水为超纯水。

1.2 色谱条件 色谱柱：Agilent Zarbox SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.0025 mol/L庚烷磺酸钠液-0.05 mol/L 磷酸二氢钾液(20:45:45) (用20%氢氧化钠液调节pH值为7.2±0.05)；流速：1.0 mL/min；检测波长：250 nm；进样量10 μL；柱温：30 ℃。

1.3 溶液的制备

1.3.1 对照品溶液：精密称取甘草酸铵对照品11.02 mg，置20 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，再精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成50.0 μg/mL甘草酸铵对照品溶液。

1.3.2 供试品溶液：取本品，摇匀，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇15 mL，超声处理10 min，取出，放冷，用甲醇稀释至刻度，摇匀，初滤，取续滤液，即得。

1.3.3 缺甘草的阴性样品溶液：取缺甘草的阴性样品约5 mL，同法制备缺甘草的阴性样品溶液。

1.4 测定条件的选择

1.4.1 检测波长：取甘草酸铵对照品适量，用流动相制成15 μg/mL溶液，于UV-2501紫外分光光度计上在300～200 nm之间作波长扫描。

1.4.2 样品提取条件：

① 提取溶剂考察：舒肺合剂是采用传统水煎煮方式提取，水溶性杂质较多，选用甲醇、乙醇作溶剂，对除杂质效果进行了考察；

② 甲醇量考察：由于本品为液体制剂，提取时甲醇浓度会影响甘草酸铵的含量及除去水溶性杂质的效果。精密量取本品5 mL，共3份，置25 mL量瓶中，分别加入甲醇10、15、20 mL，超声处理10 min，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，滤液澄清，取续滤液10 μL进样，测定含量；

③ 超声处理时间考察：精密量取本品5 mL，精密称定，共3份，置25 mL量瓶中，各加甲醇15 mL，分别超声处理5、10、20 min，取出，放冷，加甲醇至该度，摇匀，滤过，取续滤液10 μL进样，测定含量；

④ 专属性试验：取对照品溶液、供试品溶液和缺甘草的阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。

1.5 方法学考察

1.5.1 精密度试验：取对照品溶液(甘草酸铵浓度为50.0 μg/mL)10 μL，重复进样6次检测峰面积。

1.5.2 重复性试验：取同一批样品(批号：20150121)，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液5份，按本文给定的色谱条件测定甘草酸铵的含量。

1.5.3 线性关系试验：精密称取甘草酸铵对照品8.50 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，再精密量取0.3，0.5，0.7，1.0，1.5 mL，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。各精密量取10 μL，注入液相色谱仪，每个浓度进样2次，测定平均峰面积。以峰面积积分值(Y)为纵坐标，甘草酸铵对照品浓度X(μg/mL)为横坐标进行线性回归，得回归方程。

1.5.4 稳定性试验：取重复性试验项下同一批供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、24 h，精密量取10 μL进样，测定甘草酸铵峰面积。

1.5.5 加样回收率试验：精密量取已知含量的舒肺合剂(批号20150121，甘草酸铵平均含量为0.2765 mg/mL)5 mL，置50 mL量瓶中，共6份，各精密加入甘草酸铵对照品甲醇溶液(含甘草酸铵1.3881 mg/mL)1 mL，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“1.5.6”项下方法测定甘草酸铵含量，计算回收率。

1.5.6 样品测定：取样品3批，按“1.3.2”项下方法制备供试品溶的液，按本文给定的色谱条件测定；另取“1.3.1”项下对照品溶液同法测定作对照，计算样品中甘草酸铵含量。每批样品测定5次。

2 结果

2.1 测定条件的选择

2.1.1 检测波长：最大吸收波长为250 nm，故选择检测波长为250 nm。

2.1.2 样品提取条件：①提取溶剂：用甲醇作溶剂，去杂质效果佳，溶液易滤过，滤液澄清，故选用甲醇作溶剂；

② 甲醇量：加甲醇15～20 mL，甘草酸铵含量不变，故选定加甲醇15 mL；

③ 超声处理时间：超声处理10～20 min时甘草酸铵含量不变，故选定超声时间为10 min；

④ 专属性：对照品溶液中甘草酸铵保留时间为9.736 min，峰形对称；供试品溶液中甘草酸铵与其它组分峰分离良好，分离度R>1.5，理论板数为2647；缺甘草的阴性样品溶液在与甘草酸铵保留时间相同处无出现干扰峰，表明专属性好。见图1。

图1 舒肺合剂的HPLC色谱图A.甘草酸铵对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性样品溶液；1.甘草酸铵Fig.1 HPLC chromatogram of Shufei MixtureA.ammonium glycyrrhizinate standard solution；B. sample solution；C. negative solution；1.ammonium glycyrrhizinate

2.2 方法学考察结果

2.2.1 精密度试验：峰面积的RSD= 1.01%(n=6)，表明精密度良好。

2.2.2 重复性试验：5次测定甘草酸铵含量分别为0.2755、0.2778、0.2740、0.2785、0.2766 mg/mL，得含量的RSD =0.65%(n= 5 )，表明重复性良好。

2.2.3 线性关系试验：线性回归方程为Y=0.1133X-0.00110，r=0.999 8。结果表明：甘草酸铵在23.6～118.1 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.4 稳定性试验：6次测定甘草酸铵峰面积的RSD=0.65%，表明样品溶液在配制后24h内稳定。

2.2.5加样回收率试验：平均回收率为97.8%，RSD=0.88%。见表1。

表1 加样回收率测定结果(n=6)Tab.1 Result of average recovery(n=6)

2.2.6 样品测定： 3批样品中甘草酸铵的平均含量为0.2721 mg/mL。见表2。

表2 样品测定结果 (n=5)Tab.2 Result of sample determination(n=5)

3 讨论

曾试验用甲醇-水作流动相，甘草酸铵保留时间过长，柱效低；改用乙腈-水作流动相，可缩短甘草酸铵的保留时间，但对舒肺合剂中甘草酸铵与其他组分的分离效果较差，其中有一较大峰较难分离。采用庚烷磺酸钠作为离子对试剂以增加甘草酸铵在乙腈-水流动相中的保留时间，同时为了提高甘草酸铵的柱效和峰形对称性，添加了磷酸二氢钾。比较不同浓度庚烷磺酸钠、磷酸二氢钾及流动相的pH值对甘草酸铵与相邻杂质峰的分离，通过调节有机相与水的比例以达到甘草酸铵峰形对称、保留时间适中，柱效高并与相邻峰完全分离的目的。确定的最佳流动相条件为乙腈-0.0025 mol/L庚烷磺酸钠液-0.05 mol/L 磷酸二氢钾液(20:45:45)(用20%氢氧化钠液调节pH值为7.2±0.05)。同时比较了Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×15 cm，5 μm)、Extend-C18柱(4.6 mm×15 cm，5 μm)和ZARBOX Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×25 cm，5 μm)3种不同色谱柱。试验结果以Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)为佳。在给定的色谱条件下，一次进样在32 min内出峰完毕，定量准确性和进样精密度均好。

3批舒肺合剂样品测定甘草酸铵含量范围在0.2532～0.2865 mg/mL之间，平均为0.2721 mg/mL。考虑到不同产地甘草中甘草酸铵含量有差异以及贮存期含量的变化等因素，在制定舒肺合剂标准时甘草酸铵最低含量拟控制在平均值的80%，即甘草酸铵含量不得低于0.22 mg/mL。

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(编校：王俨俨)

Determination of ammonium glycyrrhizinate in Shufei Mixture by RP-HPLC

WU Xue-dan1, JI Yan-ping2, DU Jing3, FU Ying-hua2Δ

(1.Department of Pharmacy, First People’s Hospital of Xiangshan County, Xiangshan 315700, China; 2. Department of Pharmacy, College of Medicine, Jiaxing University, Jiaxing 314001, China; 3. Department of Pharmacy, Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou 310009, China)

ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for determination of ammonium glycyrrhizinate in Shufei Mixture.MethodsThe sample was analyzed on an Agilent Zorbax SB-C18column (4.6mm×150 mm, 5 μm), and acetonitrile-0.0025 mol/L sodium heptanesulfonate solution-0.05 mol/L potassium dihydrogen phosphate solution(20:45:45) (adjusted pH value of 7.2±0.05 with 20% sodium hydroxide solution)was used as mobile phase. The flow rate was at 1.0 mL/min. The detective wavelength was at 250 nm. The column temperature was 30 ℃.ResultsWith this chromatographic condition, the ammonium glycyrrhizinate peak in Shufei Mixture sample chromatogram could be separated with other ingredient peaks completely. The negative sample had no interference. The calibration curve was linear at a ranges of 23.6-118.1 μg/mL for ammonium glycyrrhizinate, and equation of regression wasY=0.1133X-0.00110，r=0.999 8. The average recovery from sample was 97.8% and RSD was 0.88%(n=6). The content range of ammonium glycyrrhizinate in three batch Shufei Mixture sample was 0.2532-0.2865 mg/mL, and average content was 0.2721 mg/mL.ConclusionThis method is simple, accurate, and useful for control method of this preparation.

RP-HPLC; ammonium glycyrrhizinate; Shufei Mixture; content determination

吴雪丹，女，本科，副主任药师，研究方向：医院药学，E-mail：lwphxd@126.com；傅应华，通信作者，女，本科，教授，研究方向：药物制剂与质量控制，E-mail：yaoji6217@sohu.com。

R917

A

1005-1678(2015)11-0175-03