基于假病毒的人乳头瘤病毒小鼠感染模型的建立及HPV16 VLP疫苗保护性评价

王大宁，张丽，刘亚静，魏希，夏宁邵,4，李少伟,4Δ

(1.厦门大学 公共卫生学院/分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，福建 厦门 361102；2.厦门大学 医学院，福建 厦门 361102；3.厦门万泰沧海生物技术有限公司，福建 厦门 361000；4.厦门大学 生命科学学院/国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建 厦门 361102)



基于假病毒的人乳头瘤病毒小鼠感染模型的建立及HPV16 VLP疫苗保护性评价

王大宁1，张丽2，刘亚静1，魏希3，夏宁邵1,4，李少伟1,4Δ

(1.厦门大学 公共卫生学院/分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室，福建 厦门 361102；2.厦门大学 医学院，福建 厦门 361102；3.厦门万泰沧海生物技术有限公司，福建 厦门 361000；4.厦门大学 生命科学学院/国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，福建 厦门 361102)

目的 建立基于假病毒的人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)小鼠感染模型并应用于HPV16 VLP疫苗的保护性评价。方法 利用293FT细胞制备携带Luc报告基因的HPV16假病毒，纯化后检测HPV16假病毒滴度和性质；利用醋酸甲羟孕酮和β-雌二醇处理雌性BAL B/c小鼠，然后用壬苯醇醚-9(N-9)化学损伤BALB/c小鼠阴道，6 h后用HPV16假病毒感染小鼠阴道，48 h后使用活体检测仪检测小鼠阴道中Luc报告基因的表达情况；最后，利用该感染模型评价HPV16 VLP疫苗的保护能力。结果 获得了含有Luc报告基因的HPV16假病毒，建立了HPV假病毒纯化方法；Western blot结果显示HPV16假病毒中含有L1和L2蛋白；建立了HPV假病毒感染小鼠模型，并通过不同剂量的假病毒感染实验表明，该感染模型所需的最低假病毒剂量是1.7×104TRLU；利用该模型获知HPV16 VLP疫苗具有较强的抵抗HPV16假病毒感染的能力，当中和抗体滴度为256时即可阻碍HPV假病毒感染。结论 本研究成功地建立了HPV假病毒小鼠感染模型，并运用该模型评价了HPV16 VLP疫苗的保护作用，为HPV中和抗体研究和候选疫苗的免疫保护评价提供了有效工具。

人乳头瘤病毒；假病毒；小鼠感染模型；中和保护

人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染能引起宫颈癌、尖锐湿疣等多种疾病，严重威胁人类的健康[1]。人乳头瘤病毒疫苗是预防HPV感染以及相关疾病的有效手段[2]。目前世界上已有3种HPV疫苗上市，即Merck公司Gardasil(HPV6/11/16/18四价疫苗)和Gardasil 9(HPV6/11/16/18/31/33/45/52/58九价疫苗)以及GSK公司Cervarix(HPV16/18二价疫苗[3]。国内也有企业正在积极进行HPV预防性疫苗的研制，并有多家企业产品进入了临床试验阶段[4-6]。

免疫原性评价是HPV预防性疫苗临床研究中的重要内容。目前广泛采用的假病毒-细胞中和法能够直接检测具有中和活性的所有抗体，且不受抗原表达系统来源的影响[7-8]。但该方法使用人肾细胞作为受体细胞，只能在细胞水平上检测血清是否具有阻碍假病毒感染的能力。无法真实模拟在体内复杂的阴道、子宫颈等微环境中，具有组织特异性的HPV感染及其被中和的情况，对疫苗的临床评价具有一定的局限性。因此，亟需发展一种能更真实模拟HPV感染的动物体内模型，用于HPV预防性疫苗免疫保护评价、HPV中和抗体研究、HPV疫苗的主动免疫和HPV感染研究。

本研究旨在以假病毒-细胞中和法为基础制备以luc基因作为报告基因的HPV16假病毒，并对该假病毒进行了性质检测以及定量；并基于该假病毒建立HPV假病毒感染小鼠阴道模型，以进一步优化假病毒感染小鼠阴道的假病毒用量，另使用该方法评价不同剂量HPV16疫苗的保护能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和细胞： DH5α株大肠杆菌为本实验保藏；AAV-HPV16 L1、AAV-HPV16 L2和pN31-EGFP质粒由J.T.Schiller教授惠赠[9]；表达luciferase质粒(PST-luc)由本实验室构建；293FT细胞购自美国Invitrogen公司；HPV16 L1抗体PD4和8A9 以及HPV16 L2抗体14H6由本实验室构建；HPV16 VLP疫苗与铝佐剂为本实验室制备[10]。

1.1.2 实验动物：选取4～6周龄，体质量约20g的BALB/c小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，饲养于厦门大学分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室SPF级动物房内。本实验遵循《实验动物保护条例》，得到本校实验动物伦理委员会批准，厦门大学实验动物许可证号：SCXK(闽)2013-0001。

1.1.3 试剂： PEI转染专用试剂购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基购自美国GIBCO公司；优级胎牛血清(Fetal Calf Serum，FBS)购自德国PAA公司；牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)购自AppliChem公司；三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)、荧光素酶(D-luciferase)、β-雌二醇(β-Estradiol)、壬苯醇醚(Nonoxynol-9，N-9)和羟甲基纤维素(Carboxymethylcellulose，CMC)均购自美国Sigma-Aldrich公司；医用醋酸甲羟孕注射液(DepoProvera)购自厦门中山医院。

1.1.4 仪器：AKTA纯化设备， AKTA purifier，美国GE公司；透射电镜，Tecnai G2 Spirit，美国FEI公司；酶标仪，PHOMO，安图实验仪器(郑州)有限公司；Xenogen可见光小动物活体成像系统，Ivis LuminaⅡ，Caliper Life Science。

1.2 方法

1.2.1 HPV16假病毒制备及性质鉴定

① 聚醚酰亚胺(Polyetherimide，PEI)转染法生产HPV16假病毒：HPV假病毒制备方法参考已有报道[8,11-12]。简述如下：将293 FT细胞铺于10 cm细胞培养板中，当细胞密度长至80%后，将10 μg AAV-HPV16 L1、1 μg AAV-HPV16 L2和10 μg pN31-EGFP或PST-Luc质粒充分混匀，与PEI混合(质粒与PEI质量比为1:3)震荡10s；静置10～20 min后，将上述混合液均匀的加入预铺的293FT细胞中，轻轻摇匀，37 ℃培养箱中培养4 h；4 h后更换培养基，转染72 h后，收集细胞，用相同体积的裂解液在37 ℃条件下裂解16 h，收集上清并转移至无菌Ep管中，再加入0.19倍(体积比)的5M NaCl，4 ℃保存备用。

② HPV16假病毒纯化：收获假病毒后，使用AKTA纯化设备和Core 700层析介质纯化HPV16假病毒。纯化缓冲液为10 mM PB 6.5+0.5 M NaCl,Core 700层析柱经缓冲液平衡后，将2 mL假病毒泵入层析介质中，分段收集样品峰进行浓度检测。

③ 透射电镜观察HPV16假病毒颗粒： 取15 μL HPV16假病毒吸附在镀碳的通网上，吸附5 min，干燥，用2%pH6.4磷钨酸染色5 min；使用FEI Tecnai G2透射电镜观察HPV假病毒形态结构。

④ 双抗夹心ELISA检测HPV16假病毒：基于本实验室建立的HPV VLP双抗检测方法，采用HPV16 L1 构象性双抗夹心系统(PD4：8A9-HRP)测量假病毒的浓度。HPV16 L1抗体PD4包被96孔ELISA板，将HPV16 VLP稀释至1 μg/mL，加入首孔，双孔重复，2倍梯度系列稀释；HPV16假病毒稀释100倍后加入首孔，2倍梯度系列稀释，37 ℃温育45 min，1×PBST清洗5次；加入二抗8A9-HRP(1:2000)37 ℃温育45 min，1×PBST清洗5次；加入A，B显色底物(北京万泰生物股份有限公司)在37 ℃温育10 min后加入终止液，放置酶标仪中使用450 nm和620 nm双波长进行检测。根据HPV16 VLP在线性范围内的OD值与浓度关系绘制标准曲线，将HPV16假病毒反应的OD值带入标准曲线计算出假病毒的浓度(用L1蛋白浓度(μg/mL)表示)。

⑤ Western blot分析HPV16假病毒：取100 μL纯化后的HPV16假病毒，加入20 μL 6×蛋白上样缓冲液(100 mM pH6.8 Tris-HCl，200 mM BME，4%SDS，0.2%溴酚蓝和20%甘油)，80 ℃加热10 min，10%SDS-PAGE电泳；电泳结束后将蛋白转移至醋酸纤维素膜上，加入5%脱脂奶封闭1 h，加入HPV16 L1抗体21A5和HPV16 L2抗体14H6[12]室温反应1 h，加入含0.2%Tween-20的PBS清洗3次；加入二抗(HRP标记的驴抗鼠)反应1 h，清洗3次，曝光显色。

1.2.2 HPV16假病毒滴度鉴定：收获假病毒后将其感染293FT细胞进行滴度鉴定，细胞感染在96孔细胞培养板中进行。①含GFP报告基因的假病毒滴度鉴定：采用TCID50法进行检测，假病毒10倍梯度倍稀，稀释6个梯度， 每个稀释倍数8孔重复，荧光Elispot检测每孔感染情况，计算出假病毒的TCID50；② 含luc报告基因的假病毒滴度鉴定：首孔将假病毒稀释至50 g/mL，8孔重复，依次2倍倍稀释，感染细胞48 h后用活体成像仪检测，计算假病毒稀释前滴度，滴度单位为TRLU/mL。TRLU(transducing relative light units)是能使细胞产生荧光信号的假病毒最高稀释浓度的倒数。

1.2.3 假病毒感染小鼠阴道模型的建立及不同假病毒用量对感染的影响

① 假病毒感染小鼠阴道模型的建立：假病毒感染小鼠阴道之前，先用β-雌二醇和醋酸甲羟孕酮(DepoProvera)使小鼠进入动情期。即每只小鼠皮下注射0.1 μg β-雌二醇，24 h后每只小鼠再皮下注射3 mg 醋酸甲羟孕酮。12 h后，用气体麻醉系统(XGI-8)麻醉小鼠，将50 μL 4%(v:v)N-9灌入小鼠阴道内进行化学损伤。6 h后，取25 μL HPV16假病毒与15 μL 4%CMC的混合物灌入小鼠阴道内进行感染，对照组小鼠只灌入40 μL 4%CMC进行处理；假病毒感染48 h之后，麻醉小鼠，取50 μL 15 mg/mL D-Luciferase灌入小鼠阴道内促使小鼠阴道上皮细胞内的luc发光，3 min后利用Xenogen小动物体内可见光成像系统(IVIS，Caliper Life Science)检测小鼠体内荧光素酶的表达情况。在HPV16 VLP疫苗保护评价实验中，疫苗免疫8周后，用β-雌二醇和醋酸甲羟孕酮处理小鼠，然后按照上述流程进行小鼠阴道感染和荧光检测。

② 为研究HPV假病毒使用剂量对感染结果的影响，及在已知假病毒滴度下最的低感染剂量，设计5个不同的感染剂量，分别是5、10、15、20、25 μL，每个剂量3只小鼠，对照组3只小鼠感染PBS。假病毒感染48 h后，活体成像仪检测感染结果。

1.2.4 HPV6 VLP疫苗免疫阻碍HPV16假病毒感染小鼠阴道

① HPV16 VLP疫苗免疫小鼠：将16只4～6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成4组，分别免疫100、33.3、11.1 ng的HPV16 VLP疫苗[10]和铝佐剂(作为阴性对照)，每组4只。免疫程序是分别在0、2、4周进行免疫，共3次。首次接种第8周后眼眶采血检测各组小鼠血清中HPV16的中和抗体滴度。

② 免疫血清中和滴度检测：血清中和检测方法参考已有报道[13]，简述如下，将293FT细胞以1.5×104个/孔的密度铺于96孔细胞培养板中，37 ℃培养4～6 h。血清用含10%FBS的DMEM稀释1000倍后加入96孔U型板首孔，再用10%FBS DMEM进行2倍梯度稀释。取60 μL稀释后的血清分别与60 μL用10%DMEM稀释后的HPV16假病毒(携带GFP报告基因)混合，室温孵育1 h后取100 μL加入预铺有293FT细胞的96孔板中，37 ℃培养72 h后先在荧光显微镜下观察，再用荧光Elisopt检测各孔细胞的感染率，计算血清的中和滴度。感染率=细胞样品在阳性区中的细胞数量百分率-未感染的对照细胞样品在阳性区的数量百分率。感染抑制率=(1-阻断孔的感染率/未阻断孔的感染率)×100%。血清中和滴度的定义为：达到高于50%感染抑制率的最大稀释倍数。经过稀释后能达到50%以上感染抑制率的单抗或多抗被视为具有中和能力。

2 结果

2.1 携带Luc报告基因的HPV16假病毒制备及性质鉴定

2.1.1 携带Luc报告基因的HPV16假病毒制备：透射电镜观察结果显示：假病毒被细胞内的杂蛋白包围，假病毒纯度较低，不利于后续实验，见图1A。经Core 700层析纯化后，HPV16假病毒纯度显著提高，杂蛋白明显减少，HPV16假病毒的颗粒形态更加清晰，假病毒颗粒规则饱满，大小均一，直径约60 nm，见图1B。

图1 透射电镜观察HPV16假病毒(×25,000) A：纯化前；B：Core 700 层析纯化后Fig.1 TEM visualization of HPV16 pseudovirus(×25,000)A:Before purified;B:After purified by Core 700 chromatography

2.1.2 HPV16假病毒定量和定性检测：双抗夹心系统得到的标准曲线为“Y=0.0093X+0.1869”，见图2A。计算出假病毒中L1的浓度是20.5 μg/mL。Western blot结果显示纯化后的假病毒中也含有L2蛋白，但L1的含量明显高于L2的含量，见图2B。L2蛋白理论分子量约为50 kDa，而电泳结果显示L2蛋白条带位于70 kDa左右，这与目前报道的结果一致[14]。

图2 HPV16假病毒定量和定性检测 A：双抗夹心测量L1含量；B：Western blot检测HPV16假病毒Fig.2 Quantity and quality assay for HPV16 pseudovirusA:double-antibody sandwich ELISA for detecting HPV16 pseudovirus；B:L1 and L2 of HPV16 pseudovirus detected by Western blot

2.2 携带Luc报告基因的HPV16假病毒感染滴度测定 根据活体成像仪检测的荧光信号强度读值和假病毒稀释倍数，计算出假病毒稀释前滴度为8.84×105TRLU/mL。

2.3 假病毒感染小鼠阴道模型的建立及不同假病毒用量对感染的影响

2.3.1 假病毒感染小鼠阴道模型的建立：活体成像仪结果显示：HPV16假病毒成功感染小鼠阴道组织，见图3B。对照组没有荧光信号，见图3A。为检测该荧光信号的持久性，每隔3 min检测一次，连续检测12次，发现加入荧光素酶底物15～20 min后信号达到较高值，荧光信号可持续近40 min，见图3C。

图3 活体成像仪检测HPV16假病毒感染小鼠阴道(n=3)A：对照组；B：感染HPV16假病毒组；C：连续测量小鼠阴道内荧光信号强度Fig.3 In vivo luminescence imaging in mouse after treatment with HPV16 PsV(n=3)A:Control; B:Treated with HPV16 PsV-Luc; C:Measured in photons/s/cm2/sr

2.3.2 不同假病毒用量对感染的影响：活体成像检测结果显示：对照组(假病毒感染剂量为0)和HPV16假病毒感染剂量为5、10、15 μL时均未检测出病毒感染信号，见图4A、4B、4C、4D。当HPV16假病毒感染剂量为20、25 μL时，能够检测到荧光信号，见图4E、4G。且25 μL感染剂量组产生的荧光强度要明显高于20 μL感染剂量组，见图4H。假病毒滴度为8.84×105TRLU/mL，本实验表明，1.7×104TRLU的HPV16假病毒即可成功感染小鼠阴道上皮组织，并能被激发出足够的荧光被活体成像仪检测到。为充分保证实验良好的再现性，给与2.2×104TRLU的HPV16假病毒用量。

图4 不同剂量的HPV16假病毒感染小鼠阴道(n=3)A：对照组；B-G：感染不同剂量假病毒组；H：连续测量各组小鼠阴道内荧光Fig.4 In vivo luminescence imaging after treatment with serial dosage of HPV16 PsV(n=3) A:Control; B-G:Treated with different dosages of HPV16 PsV-Luc;H:Measured in photons/s/cm2/sr

2.4 HPV6 VLP 疫苗免疫阻碍HPV16假病毒感染小鼠阴道 HPV16假病毒抗体中和滴度检测结果显示：11.1 ng疫苗接种产生的中和抗体滴度约为360，对照组不产生中和抗体，见图5A。为进一步评价疫苗诱导产生的中和抗体抵御HPV感染的能力，将含有Luc报告基因的HPV16假病毒(剂量为3.0×104TRLU)感染小鼠，48 h后进行检测，结果显示：只有对照组的小鼠阴道部位出现明显的感染信号，3组接种不同剂量的小鼠均没有感染HPV16假病毒，见图5B。表明HPV16 VLP疫苗具有较好的预防HPV感染的能力，HPV16疫苗免疫小鼠产生的中和抗体滴度为256时即可完全抵御HPV16假病毒的感染。

图5 HPV16 VLP疫苗免疫小鼠保护HPV16假病毒感染(n=4)A：不同剂量HPV16 VLP疫苗免疫后诱导中和抗体滴度；B：活体成像仪检测接种不同浓度疫苗后的小鼠阴道抵御HPV16假病毒感染情况Fig.5 HPV16 VLP vaccine protection against in vivo genital HPV16 PsV infection(n=4) A:HPV16 neutralizing titers measured by HPV16 PsV in vitro neutralization assay;B：Immune sera were titrated using HPV16 PsV neutralization assay

3 讨论

本文利用PEI转染法获得包裹Luc报告基因的HPV16假病毒，利用透射电镜和Western Blot等检测方法表明纯化后假病毒的颗粒形态饱满，含有L2蛋白，与已报道的HPV16假病毒性质一致。双抗夹心系统检测HPV16假病毒中L1蛋白含量为20.5 μg/mL，利用活体成像仪检测HPV16假病毒感染细胞的能力是8.84×105TRLU/mL，达到进行小鼠感染的实验要求。

HPV可感染受损的粘膜上皮细胞，Elenius等[[15]利用免疫组化和原位杂交技术发现受损的上皮细胞在进行伤口愈合过程中，硫酸乙酰肝素(HSPG)的表达量显著增加。研究发现受损的小鼠阴道上皮组织可促进HPV16假病毒的感染[16]。通过注射醋酸甲羟孕酮使小鼠进入动情间期，壬苯醇醚-9(N-9)化学损伤其阴道，再利用HPV16假病毒感染小鼠阴道，成功的建立了假病毒感染小鼠阴道模型，且研究表明HPV16假病毒最低感染剂量为1.7×104TRLU。

利用该假病毒感染小鼠阴道模型，证明了HPV16 VLP疫苗具有很好的保护性，疫苗免疫的小鼠产生的中和抗体为256即可完全可以抵御HPV16 假病毒的感染，同时也表明了该假病毒感染模型具有较好的应用价值。

截止2015年已有3种HPV预防性疫苗上市，疫苗上市前要经历长时间的临床试验，目前普遍采用的临床试验选择的临床终点是癌前子宫颈、阴道、外阴等高度病变[17]，而HPV感染引起这些疾病的过程十分缓慢，这导致HPV疫苗临床周期很长，临床试验成本急剧增加，同时给临床试验受试者带来较大伤害。而HPV假病毒感染小鼠阴道模型给评价HPV疫苗的保护性带来了希望，该模型成本低，周期较短，操作简单，可以模拟HPV感染阴道上皮组织过程，因此该模型在研究HPV感染和评价疫苗保护性方面具有较大的潜力。

本研究基于HPV16假病毒建立的感染小鼠阴道模型，而能引起宫颈癌、阴道癌和肛门癌等相关疾病的HPV 型别达17种以上[18]，因此还需进一步研究其他型别是否适用于这一感染模型。本研究对小鼠阴道的感染情况只是通过活体成像仪检测感染产生的荧光信号的强度判断，无法观察假病毒感染引起的炎症。在2013年Kines等[19]利用微型阴道镜检测小鼠阴道病变情况，该研究在很大程度上弥补了该模型的缺点，可以更加直观地研究HPV感染及治疗。

综上所述，本研究基于Core 700层析纯化的包裹Luc报告基因的HPV16假病毒，成功地建立了HPV假病毒小鼠感染阴道模型，为HPV预防性疫苗免疫保护评价、HPV中和抗体研究、HPV治疗性疫苗开发和HPV感染研究提供了有利条件。

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(编校：吴茜)

Establishment of human papillomavirus pseudovirion infection model in mouse for potency evaluation of HPV16 VLP Vaccine

WANG Da-ning1, ZHANG Li2, LIU Ya-jing1, WEI Min-xi3, XIA Ning-shao1,4, LI Shao-wei1,4Δ

(1.State Key Laboratory of Molecular Vaccinology and Molecular Diagnostics, School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, China; 2. School of Medicine, Xiamen University, Xiamen 3611024, China; 3. Xiamen Innovax Biotechnology Co.,Ltd., Xiamen 361000, China; 4.National Institute of Diagnostics and Vaccine Development of Infectious Diseases, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China)

ObjectiveTo establish a mouse model of genital human papillomavirus (HPV) pseudovirion (PsV) transmission and evaluate the protective potency of HPV16 VLP vaccine.MethodsHPV16 PsV with the encapsidated luciferase expressing plasmid Luc were generated from 293FT cells and purified by size-exclusion chromatography. The endpoint titers of HPV16 PsV-Luc were determined on 293FT cells, denoted as TRLU/mL. For in vivo genital challenge, mice were synchronized in a diestrus-like status by a subcutaneous injection with 0.1 μg β-estradiol and then with 3mg DepoProvera after 24 hours. Six hours prior to HPV16 PsV-Luc challenge, deeply anesthetized mice were intravaginally pretreated with 50 μL of 4%nonoxynol-9 (N-9). HPV16 PsV-Luc was thoroughly mixed with 20 μL solution containing 4%carboxymethylcellulose (CMC) and intravaginally instilled using a positive-displacement pipette. Forty-eight hours after PsV-Luc challenge, mice were anesthetized and D luciferin was intravaginally instilled. After 3 minites, bioluminescence was measured with a cryogenically cooled Xenogen IVIS camera system. Then，the murine genital challenge model was used to determine the potency that HPV16 VLP vaccine is efficient at preventing HPV infection.ResultsHPV16 PsV-Luc was generated and purified from 293FT cells. HPV16 PsV-Luc was verified to containe L1 and L2 protein by Western blot. HPV 16 PsV-Luc successfully infected vaginal epithelial cells of mouse and the murine genital challenge model was established. To achieve consistent bioluminescence, the minimal dose of HPV16 PsV-Luc was 1.7×104TRLU. The protective potency of HPV16 VLP vaccine was shown using this murine model. Our data showed that immune serum with over neutralizing antibody titer of 256-fold was sufficient to confer protection against HPV PsV genital infection.ConclusionThe murine genital challenge model of HPV16 was successfully established, and the model is used to evaluate the potency of HPV16 VLP vaccine against in vivo genital HPV16 PsV challenge. Our model will benefit for the investigation of HPV neutralization and the potency evaluation of the HPV vaccine.

human papillomavirus; HPV pseudovirus; pseudovirion infection model; protective potency

国家自然科学基金(81172885)

王大宇，男，博士在读，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail:haining411@163.com;李少伟，通信作者，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：分子病毒学，E-mail:shaowei@xmil.edu.cn。

R373

A

1005-1678(2015)11-0005-06