猪链球菌广东株的分离鉴定及药敏试验

彭 凌，杨旭夫，朱必凤，刘博婷

（韶关学院粤北生猪生产及疫病防控协同创新发展中心，英东生命科学学院，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所-韶关学院动物疫病诊断中心联合实验室，广东韶关 512005）

猪链球菌（Streptococcussuis，SS）是一种重要的人兽共患病病原体，多年来一直困扰我国养猪业发展，按其荚膜抗原的差异，可分为35个血清型（1～34及1／2），对猪致病性较强的血清型是1型、2型、1／2型、7型和9型［1］。症状主要为脑膜炎和败血症，发病率和病死率均较高，少数育肥猪则以关节炎型为主要特征，给养猪业造成了巨大的经济损失，并对相关从业人员的生命安全构成严重威胁。2005年6月～7月份发生在四川省资阳、内江等地区的2型猪链球菌感染事件造成了一定的社会影响和极大的经济损失，引起广泛关注［2］。虽然理论上有很多药物能治疗猪链球菌病，但随着抗菌药物的广泛使用及不合理用药，使得病原菌的耐药现象日趋严重［3-4］。本试验从广东某猪场采集具有临床症状的病死猪的关节液，其中的优势病原菌疑为猪链球菌的病原菌，对其进行了形态学观察、生化试验、16SrRNA序列分析、猪链球菌2型的毒力基因检测及药敏试验，为控制该病的发生与流行提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 病料来源于广东韶关某一猪场，猪群表现为患猪体温升高，被毛粗乱，一肢或四肢关节肿胀、疼痛，有跛行，严重者不能起立。无菌采取病死猪的关节液等病变组织涂布于血清营养琼脂平板上，37℃培养24h后观察。

1.1.2 主要试剂 各类生化反应管、药敏纸片为杭州天和微生物试剂有限公司产品；DNA Marker、TaKaRaTaqenzyme为宝生物工程（大连）有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 将无菌采集的新鲜关节液涂布于血清营养琼脂平板上，37℃培养24h后观察菌落形态。挑取直径1.0mm、半透明、圆形光滑的菌落接种于血清营养琼脂平板纯化。挑取纯培养物的单个菌落，进行革兰染色，镜检。

1.2.2 生化鉴定 从分离得到的菌株的纯培养物中挑取单个典型菌落，按照杭州天和微生物试剂有限公司反应管说明书进行。

1.2.3 基因组DNA的提取 取适量的培养物离心收集菌体，沉淀物加入567μL的TE缓冲液重悬，加入30μL 100g／L的SDS和3μL 20mg／mL的蛋白酶K，振荡充分混匀，于37℃水浴锅中温育1h，直到溶液变得透明为止。加入100μL 5mol／L NaCl，充分混匀，再加入80μL CTAB／NaCl溶液，混匀，于65℃温育10min；加入等体积的酚／氯仿／异戊醇（25∶24∶1）混匀，10 000×g离心5min，取上清，再用酚／氯仿／异戊醇抽提1次；加入0.6倍体积的异丙醇（约450μL），轻轻混合，经10 000×g离心10min，弃上清，沉淀用700mL／L乙醇洗涤2次，重溶于TE缓冲液中，4℃冰箱中保存备用。

1.2.4 1 6SrRNA序列测定 根据文献［5-6］设计猪链 球 菌 16SrRNA 基 因 扩 增 引 物，F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，扩增长度约为1 500bp，委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。反应体系（总体积为25μL）含：10mmol／L Tris-HCl（pH 8.3），10mmol／L KCl，2.5mmol／L MgCl2，0.4mmol／L dNTP，引物各0.5μmol／L，基因组DNA 100ng，Taq酶1.5U。扩增程序为：94 ℃5min；94℃30s，50℃1min，72℃1.5min，30个循环；72℃6min。PCR产物委托上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后进行序列测定，测序引物同PCR扩增引物，双向测通。序列测定后，通过DNA Star 7.1软件对原始测序数据进行校对分析，建立完整可靠的序列，并通过采用GenBank数据库中Blast程序与已知序列进行相似性分析，对菌株进行鉴定。

1.2.5 PCR分型鉴定 根据文献［7］合成对猪链球菌2型荚膜多糖（cps2J）特异性引物，cps2J-s：5′-GTTGAGTCCTTATACACCTGTT-3′，cps2J-as：5′-CAGAAAATTCATATTGTCCACC-3′。预期扩增出的目的基因片段长度为459bp。反应体系（总体积为25μL）含：10mmol／L Tris-HCl（pH 8.3），10mmol／L KCl，2.5mmol／L MgCl2，0.4mmol／L dNTP，引物各0.5μmol／L，基因组 DNA 100ng，Taq酶1.5U 。扩增程序为：94℃2min；94℃30s，55 ℃ 30s，72 ℃ 1min，35个循 环；72 ℃6min。扩增产物用14g／L的琼脂糖凝胶进行电泳，利用Master VDS凝胶成像系统进行拍照。

1.2.6 药敏试验 采用K-B纸片法将纯化猪链球菌菌液调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同，用灭菌棉签均匀涂布于血平板上，37℃培养24h后，并用美国NCCLS标准对结果进行判定［8］。

2 结果

2.1 细菌的分离

从采集的病料中分离得到3株革兰阳性球菌，分别将其编号为SG1、SG2、SG3。分离菌株在血清营养琼脂平板上均呈半透明、表面光滑、微隆起的淡灰白色状的小菌落；镜检呈单个、成双或短链状排列的革兰阳性球菌。

2.2 生化试验

对分离到的3株革兰阳性球菌进行生化试验，3个菌株生化试验结果一致，均可发酵乳糖、蔗糖、蕈糖、葡萄糖和七叶苷，不发酵山梨糖、山梨醇、甘露醇、尿素、水杨苷、棉子糖、阿拉伯糖、甘油。生化反应结果符合猪链球菌的生化特性。

2.3 16SrRNA序列测定

通过16SrRNA的PCR扩增，3个菌株均扩增出1 500bp左右的目的片段，且产物浓度高，无非特异性杂带，与预期结果一致，可用于纯化测序。具体电泳结果见图1。

图1 16SrRNA片段PCR扩增产物Fig.1 PCR products of 16SrRNA gene fragment

将测序公司的原始数据通过DNA Star 7.1软件处理和校对，3株菌测得有效序列1 393bp，菌株之间存在5个碱基突变位点。将所得菌株的1 6S rRNA基因序列在NCBI上用Blast进行同源性比较，结果基因同源性达99%以上的参考菌株全为SS。与湖南长沙的JX207110和JX207111SS参考株关系最近，与分离株SG1、SG2、SG3的基因同源性分别为99.7%、99.8%、100%。进一步确定该细菌为SS。

2.4 PCR分型鉴定

用猪链球菌2型Cps2J引物进行PCR扩增，获得459bp大小的目的片段（图2），与预计扩增片段的分子质量一致。

图2 Cps2J片段PCR扩增产物Fig.2 PCR products of Cps2Jgene fragment

2.5 药敏试验结果

3株菌株药敏试验结果基本表现一致，均表现对头孢氨苄、头孢拉定、先锋Ⅴ、左氟沙星高度敏感；先锋噻肟、环丙沙星、氧氟沙星、恩若沙星、头孢呋肟、氟哌酸、氯霉素、利福平、洛美沙星、氟罗沙星中度敏感；呋喃妥因、多西环素、阿莫西林、复方新若明、林可霉素、克拉霉素、卡那霉素、痢特灵、红霉素、阿奇霉素、克林霉素、阿米卡星、依诺沙星、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、四环素、链霉素、罗红霉素、甲氧胺嘧啶、青霉素G等21种药物不敏感。

3 讨论

本研究从广东某发病猪场的发病猪关节液分离到3株革兰阳性球菌，生化试验鉴定为猪链球菌，将所得菌株的16SrRNA基因序列在NCBI上用Blast进行同源性比较，结果基因同源性达99%以上的参考菌株全为SS。16SrRNA基因具有高度的保守性和特异性，已经广泛应用于细菌的分类和鉴定［9-13］。根据不同属细菌16SrRNA基因同源性为70%～90%，而同一种内不同株间基因同源性＞99%［14］，从分子水平确定这3株细菌为猪链球菌。为进一步确定这3株菌的型别，我们采用已报道的扩增猪链球菌2型荚膜多糖的特异性引物对它们进行鉴定，结果这3株菌均扩增出预期的459bp的预期片段。

近年来，由于抗生素的滥用，产生了大量耐药菌株，抗生素也失去应有的作用，疾病难以控制；其次，猪链球菌具有较强的地域性，即使同一地区的不同菌株也有明显的差异，因此在用药前应做药敏试验来确定敏感药物。为指导临床用药，本试验选用目前常用的35种药物对分离到的3株猪链球菌进行了药物试验。试验结果表明，3个分离菌株对头孢菌素类、喹诺酮类、氯霉素类药物表现出敏感，而对青霉素类、大环内酯类、磺胺类、林可胺类、四环素类、氨基糖苷类等21种抗生素表现出耐药，耐药性相当严重，应引起养殖户的高度重视。

理论上很多药物对链球菌有疗效。但近年来由于抗生素的滥用，如在动物饲料中长期添加抗生素用于促进生长及预防和治疗疾病，发生疾病后未经兽医诊断就盲目大量使用多种抗生素等，不仅治疗成本提高，而且产生了大量耐药菌株，使得疾病难以控制。臧莹安等［3］对猪链球菌广东分离株的药敏试验结果发现，85%菌株对阿莫西林等药敏感，45%菌株对先锋霉素Ⅴ、先锋霉素 Ⅵ 等中度敏感，85% 以上的菌株对大环内酯类、磺胺类、氯霉素类、喹诺酮类、林可胺类和四环素类等不敏感。黄文明等［4］对猪链球菌广东分离株的药敏试验结果发现对四环素类、磺胺类和氨基糖苷类抗菌药物表现较强的耐药性，尤其对四环素类药物的耐药率高达98.2%；对头孢菌素类药物比较敏感。本文猪链球菌广东分离株的药敏试验结果与以上不尽相同，分析原因可能与各猪场用药习惯不同，进而产生耐药性不同有关。建议猪场在防治猪链球菌病时，应在确诊的基础上，通过药敏试验，有目的、有针对性地用药，避免滥用抗生素，并根据试验结果选用用2种～3种敏感药物交替用药，避免菌株耐药性的增强，尽量减少耐药菌株产生。

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