H3N2亚型禽流感病毒三重RT-PCR检测方法的建立

刘婷婷，谢芝勋，宋德贵＊，罗思思，谢丽基，李 孟，谢志勤，邓显文

（1.广西师范大学生命科学学院，广西桂林 541000；2.广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁 530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是危害禽类养殖的一类重要传染病，其病原禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）为单股负链的RNA病毒，分8个节段，分别编码 HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白［1］。在AIV 8个基因片段中，M基因是最保守的基因片段，所有亚型AIV的PCR检测均选择M基因作为靶基因。HA、NA是变异最大的两个基因节段，两者之间存在的某种平衡对病毒的致病性有很大关系［2］。根据HA、NA基因抗原性差异，AIV可进一步分为不同的亚型，目前已鉴别出18种HA（H1-H18）亚型和11种NA（N1-N11）亚型［3-4］。H3亚型AIV属于低致病性AIV，其在低致病性AIV中占有较重要地位［5］。研究表明，H3亚型AIV在家禽中分离率较高，且在不同家禽中分布的季节性与我国人群中流感流行的季节性比较一致［6-8］，这就为两种宿主的流感病毒在猪这个“混合器”中发生基因重排提供了条件。1968年暴发的香港流感病毒 A／HongKong／68（H3N2）经研究推测是由H3亚型AIV与H2N2亚型人流感病毒在猪体内发生基因重排而产生的［9-10］。此外，N2亚型（H9N2）AIV是感染家禽并能致病的常见NA亚型，其可与大多数HA亚型AIV组合形成不同血清型的AIV。因此，建立一种简便、快速检测AIV且能同时鉴别H3N2亚型AIV的方法对我国养禽业和公共卫生都有重要意义。

长期以来，针对AIV的检测主要依靠传统的病原分离鉴定与血清学试验，这些方法耗时较长，给诊断带来了一定的局限性。随着分子生物学和生物试剂的不断发展，PCR（RT-PCR）检测方法已成为病毒检测的重要部分。而多重RT-PCR以其同一反应中可同时扩增出多个核苷酸片段的优势已应用于多种病毒和基因的同时检测［11-15］。目前专门针对H3N2亚型AIV的PCR检测方法未见报道，本研究根据AIV最保守的M基因和H3、N2亚型AIV HA、NA基因保守区域分别设计了3对特异性引物，建立了可以检测AIV且能同时进行H3、N2亚型AIV分型检测的三重RT-PCR方法，旨在为AIV的检测提供一定的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒 株 H1N1 、H1N2、H3N6 、H3N8、H4N2、H4N6、H6N1 、H6N2、H6N6、H9N2亚型AIV及6株H3N2亚型AIV分离株由广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室分离保存；H5N2、H7N2亚型AIV RNA为美国宾夕法尼亚州立大学禽病诊断研究室惠赠；新城疫病毒 （NDV）F48E9株、传染性支气管炎病毒（IBV）H52株、传染性喉气管炎病毒 （ILTV）北京株、鸡毒支原体 （MG）S6株及禽呼肠病毒（ARV）S1733株由广西兽医研究所畜禽疫苗新技术重点实验室保存提供。

1.1.2 试剂 DNA／RNA抽提试剂盒、AMV反转录酶、5×AMV buffer、dNTP和RNA酶抑制剂为宝生物工程（大连）有限公司产品；2×TaqPCR Master MIX为Invitrogen公司产品。

1.1.3 其他 SPF鸡胚为北京梅里亚公司产品；DU 800紫外分光光度计为Beckman Coulter公司产品；PCR仪为Biometra公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank中 H3、N2亚型AIV HA、NA基因序列及AIV M基因序列，用DNA Star进行比对，筛选出保守序列，利用Primer 5.0软件，设计3对特异性引物，并通过Blast验证。引物由Invitrogen公司合成（表1）。

表1 引物序列信息Table 1 Nucleotide sequences of H3and N2primers

1.2.2 病毒RNA抽提与反转录 参照DNA／RNA抽提试剂盒使用说明书抽提AIV、NDV、ARV和IBV RNA及ILTV和 MG的DNA，AIV用流感病毒12碱基反转录通用引物（序列为5′-AGCAAAAGCAGG-3′），NDV、ARV 和IBV 用随机引物，将抽提的RNA反转录成cDNA，置-30℃保存备用。

1.2.3 PCR反应体系及条件的优化 采用25.0μL反应体系：12.5μL 2×PCR Master Mix、2μL cDNA、引物 H3-F、H3-R、N2-F、N2-R、M-F、M-R（25pmol／μL）各加入0.1μL～0.5μL 5个梯度进行引物浓度优化，最后加水至25μL。根据试验结果，对PCR退火温度、扩增循环数等条件进行优化，经多次重复试验确定最佳反应程序。

1.2.4 特异性试验 利用优化后的三重RT-PCR反应体系及程序，分别以各亚型AIV及NDV、IBV、ILTV、MG和ARV的cDNA（DNA）为模板进行扩增，用15g／L琼脂糖凝胶电泳检测其特异性。

1.2.5 敏感性试验 利用Beckman UV800紫外分光光度计测定H3N2亚型AIV RNA浓度，并进行10倍倍比稀释后反转录为cDNA，以不同浓度cDNA为模板，利用优化好的反应条件进行PCR扩增，检测其敏感性。

1.2.6 临床样品检测 应用所建立的三重RTPCR方法，对96份从广西南宁市活禽市场采集的口腔和粪便拭子样品进行检测，每份样品重复3次。同时对这96份样品进行抗生素处理后，用鸡胚法分离病毒，验证方法的准确性。

2 结果

2.1 三重PCR条件的优化

通过对H3、N2亚型AIV HA、NA基因及AIV最保守M基因3对引物浓度及退火温度等条件的优化，最终确定最佳反应体系25μL包括：2×PCR Master Mix 12.5μL，H3亚型 AIV HA 基因、N2亚型AIV NA基因及AIV M基因上、下游引物（25pmol／μL）均为0.5μL，模板cDNA 2μL，加水补足25μL。反应模式为：94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，共35个循环；然后再72℃延伸10min，最后4℃结束反应。利用上述条件扩增H3、N2及H3N2亚型AIV核苷酸，结果显示均得到与试验设计大小相符的扩增条带（图1）。

2.2 特异性试验结果

特异性试验结果显示，H3N2亚型AIV可扩增出3条特异性条带，分别为518、418、271bp；H3N6和H3N8亚型AIV均有2条特异性条带出现，片段大小分别为271bp、518bp；H1N2、H4N2、H5N2、H 6N2、H7N2和H9N2亚型AIV均有2条特异性条带出现，片段大小为418bp、518bp；其他亚型AIV可扩增出1条特异性条带，片段大小为518bp；常见禽病病原体均未扩增出任何条带（图2），说明该方法有较好的特异性。

图1 三重RT-PCR体系与条件优化后扩增结果Fig.1 Amplification results of triplex RT-PCR

图2 三重RT-PCR特异性试验结果Fig.2 Specificity results of triplex RT-PCR

2.3 敏感性试验结果

利用本研究优化好的三重RT-PCR反应条件，对浓度为100ng～100fg的H3N2亚型AIV cDNA进行RT-PCR扩增，结果如图3所示，对浓度为100ng～100pg的 H3N2亚型AIV cDNA均有3条明显的扩增条带出现，片段大小分别为271、418、518bp，对浓度为10pg～100fg的H3N2亚型AIV cDNA无扩增条带。因此，该三重RT-PCR方法最低能检测到100pg的H3N2亚型AIV cDNA。

2.4 临床样品检测

在广西南宁市活禽市场96份样品中，三重RTPCR检测结果有4份呈现H3N2亚型AIV阳性，1份为H3亚型AIV阳性，17份为N2亚型AIV阳性，与病毒分离鉴定结果一致。图4为部分临床样品检测结果。

图3 三重RT-PCR敏感性试验结果Fig.3 Sensitivity results of triplex RT-PCR

图4 部分临床样品检测结果Fig.4 The detection results of clinical samples by triplex RT-PCR

3 讨论

AIV在自然界中是广泛存在的，不仅感染禽类，在猪、马、人等哺乳动物体内也可以分离到。野生水禽被认为是AIV的天然储存库，可感染所有亚型的AIV。被感染的野生水禽通过粪便将病毒排出体外，污染水系和周边环境，后经直接接触或候鸟南北迁移进一步将病毒扩散［3，16］。AIV是分节段的病毒，由于聚合酶保真性低，其基因组变异率很高，当同一宿主同时感染多种亚型的AIV，不同毒株间可能会发生基因片段的重排，产生新的AIV亚型的病毒。H3N2亚型AIV是低致病性禽流感中较常见亚型之一，在猪流感、人流感中H3N2亚型流感都为较常见流行的亚型之一，3种不同宿主的H3N2亚型流感病毒极可能在猪这个“混合器”中发生基因重排，致使H3N2亚型AIV获得直接感染人的能力。因此，建立一种简便、快速检测AIV且能同时鉴别H3N2亚型AIV的方法显得十分重要。

多重RT-PCR是一种特殊的PCR形式，其特点是在同一PCR反应中加入2对或2对以上引物可同时扩增出多个核苷酸片段，节约了试剂，简化了程序，加快了检测诊断速度，因此，多重RT-PCR方法在临床多种病原混合感染的鉴别诊断上具有很高的实用价值。本研究针对AIV最保守的M基因和H3、N2亚型AIV HA、NA基因保守区域分别设计了3对特异性引物，建立了可以检测AIV且能同时进行H3、N2亚型AIV分型检测的三重RT-PCR，特异性结果显示，该多重RT-PCR对H3N2亚型AIV可同时扩增出3条特异性条带，分别为518bp的M基因条带、418bp的NA基因条带、271bp的HA基因条带；H3亚型和N2亚型AIV均可扩增出2条特异性条带，分别为518bp、271bp和518bp、418bp；其他亚型AIV只能扩增出1条大小为518bp的M基因条带，而常见禽病病原体均未扩增出任何条带，表明本研究建立的多重RT-PCR方法具有较好的特异性。敏感性试验结果表明，该法最低能检测到100pg的H3N2亚型AIV cDNA。临床样品检测结果与病毒分离鉴定结果一致，证明了该法的有效性和实用性。因此，本研究建立的AIV H3N2亚型和M基因三重RT-PCR是一种简便、快速、有效的检测技术，具有较好的应用前景。

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