感染小肠结肠炎耶尔森菌的黄颡鱼脾脏和肾脏组织病理学观察

赵 静，王 利

（1.西南民族大学青藏高原研究院，四川成都 610041；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都 610041）

黄颡鱼（Pelteobagrusfulvidraco）是鲇形目，鲿科，黄颡鱼属中一种重要的经济淡水鱼，俗称黄辣丁或嘎牙子。黄颡鱼环境适应性极强，且肉质鲜嫩，具有极高的营养价值和经济价值，在我国多个地区已有广泛养殖。近年来，众多学者已对黄颡鱼生物学特性、人工养殖技术及感染嗜水气单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌等相关研究做了一些报道［1-4］。然而，尚缺乏有关黄颡鱼感染小肠结肠炎耶尔森菌后其脾脏和肾脏组织病理学变化的报道。

脾脏和肾脏作为鱼类重要的免疫器官和造血器官，在鱼类的非特异性免疫中发挥着不可替代的作用。目前，已有黄颡鱼、鲤鱼和红笛鲷等鱼类脾脏和肾脏组织结构的相关报道，丰富了研究鱼体免疫系统的资料，但还没有黄颡鱼感染病原菌后脾脏和肾脏病理学变化的报道［5-7］。因此，本试验对黄颡鱼感染小肠结肠炎耶尔森菌后脾脏和肾脏的组织和超微结构的病理变化进行研究，以期为该菌感染黄颡鱼的致病机理及临床诊断等相关研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

健康黄颡鱼采于成都周边某养殖场，体重平均40g±5g，体长18cm±5cm。小肠结肠炎耶尔森菌菌株GM2402，保存于-80℃冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 人工感染试验 挑选20条健康黄颡鱼随机分为2组：对照组和试验组。按照麦氏比浊法配置浓度为2.0×108cfu／mL的菌悬液用以人工感染。每条黄颡鱼注射0.15mL菌液，对照组注射等量7.5g／L生理盐水。试验期间水温控制在20℃～25℃之间，正常充氧，观察记录鱼体发病情况。试验2周后，取典型发病症状和对照组鱼体的脾脏和肾脏用于显微和超微切片的制备。

1.2.2 显微结构观察 参照金银姬和王思芦等［8-9］病理切片制作方法，具体过程如下：取患病鱼体的肾脏和脾脏组织，用100mL／L的甲醛固定，流水冲洗过夜，然后用不同浓度梯度酒精脱水、二甲苯进行透明、最后石蜡包埋。用Leica（RM2235）轮转式切片机切成厚度为5μm的薄片，HE染色，在Leica（DM2500）光学显微镜下拍照。

1.2.3 超微结构观察 将组织用25mL／L戊二醛进行固定后，磷酸缓冲液冲洗，用10mL／L饿酸再次固定，磷酸缓冲液冲洗，并依次用不同浓度的乙醇脱水，进行包埋、定位、超薄切片、醋酸铀及柠檬酸铅复染，置于透射电镜仪（Tecnia G F20型）下观察、拍照。

2 结果

2.1 临床症状及解剖变化

在两周试验期中，正常组未见异常变化，试验组在腹腔注射24h后，鱼体开始对外界刺激反应迟钝，发病率约为80%，死亡率约为50%，且表现为嘴边缘出血，胸鳍、背鳍基部严重出血，腹部肿大，肛门红肿外突，最后死亡。剖检可见腹水，脾脏肿大，呈紫黑色；肾脏肿大（图1）。

图1 黄颡鱼体病理解剖变化Fig.1 Pathological lesions of Pelteobagrus fulvidraco

2.2 组织病理学变化

显微镜下观察脾脏和肾脏出现不同程度的病理变化。

脾脏：脾脏红髓和白髓界限模糊，组织结构疏松，脾窦扩张充满红细胞（图2A）。淋巴细胞数量减少，大量红细胞充满整个脾脏组织（图2B）。

肾脏：肾脏组织结构疏松，肾小球出现萎缩，囊腔间隙增大（图2C），在肾小管和肾小球周边间质内局部有大量红细胞和淋巴细胞浸润。肾小管出现不同程度的病变，上皮细胞水肿，管腔消失并伴有胞质溶解出现空泡化（图2D）。

图2 感染小肠结肠炎耶尔森菌的黄颡鱼脾脏和肾脏病理变化Fig.2 Histopathological lesions of spleen and kidney of Pelteobagrus fulvidracoinfected with Yersina enterocolitica

2.3 超微结构观察

通过透射电子显微镜可观察到，脾脏组织的网状上皮细胞肿胀，膜边缘破损，胞核变小，巨噬细胞染色质出现边移（图3A）。脾淋巴细胞间隙增宽，细胞核固缩，染色质密度增高，胞核裂解成大小不等小体（图3B）。溶酶体数量增加，线粒体肿胀呈圆形，嵴排列紊乱。肾小管上皮细胞出现广泛性融合，胞核固缩结构模糊。肾间质的淋巴细胞胞核固缩，染色质边移，严重时核膜破裂（图3C）。溶酶体颗粒增多，线粒体肿胀呈圆形或椭圆形，嵴断裂、溶解囊泡化（图3D）。基底粗面内质网排列散乱，核糖体颗粒脱落。

图3 感染小肠结肠炎耶尔森菌的黄颡鱼超微结构变化Fig.3 Ultrastructural changes of Pelteobagrus fulvidraco infected with Yersina enterocolitica

3 讨论

肾脏和脾脏作为鱼类重要的免疫器官和造血器官，尤其是鱼类特异性免疫还未完善，在鱼类免疫系统中显得极其重要。脾脏作为鱼体体液免疫和细胞免疫的中心，含有大量淋巴细胞和巨噬细胞，可以吞噬外来病原体和衰老红细胞，提高机体抵抗力。淋巴细胞中的B淋巴细胞在抗原的刺激下可增殖分化出浆细胞，参与抗肿瘤或其他免疫机制。已有研究表明瓦氏黄颡鱼、草鱼等硬骨鱼类的脾脏结构十分相似，脾脏动脉中充满红细胞，组织中存在大量淋巴细胞和粒细胞［10-12］。祁保霞等［5］研究报道黄颡鱼的脾脏结构清晰，含有大量淋巴细胞和粒细胞。而本试验结果显示脾窦充血，组织间隙充满大量红细胞，表明病鱼脾脏组织结构受到破坏，致使造血机能受损，影响血液循环和代谢机能，免疫力下降。刘小玲等［13］研究报道黄颡鱼的肾脏中分布着大量淋巴细胞，这与本试验研究结果一致。黄颡鱼感染小肠结肠炎耶尔森菌后肾小球萎缩，导致过滤功能发生严重障碍，但这与黄颡鱼出现腹水症和红头病后病变明显不同，可能是由于病原菌不同所致［14-16］。肾小管上皮细胞出现水肿、变性，这与黄河鲤出现烂鳃病时，肾脏的病变相似［17］。肾小管上皮细胞水肿变性影响了重吸收和分泌功能，这在一定程度上加速鱼的发病死亡。

超微结构观察肾脏和脾脏组织细胞中线粒体损伤最严重，表现为肿胀，嵴断裂、消失。线粒体是细胞内重要的能量代谢场所，同时也是细胞呼吸代谢中心。线粒体结构的破坏必然影响细胞内各种生化活动的正常进行，能量来源的中断致使细胞内外钠钾泵平衡失调，造成细胞内钠离子潴留，导致细胞表现出肿胀。这与罗非鱼、高体鰤在感染海豚链球菌、类结节病后线粒体受损一致［18-19］。线粒体结构的破坏，致使机体能量供应不足，导致组织细胞发生广泛性损伤，但线粒体的变化是否会对鱼体发病机理的深入研究具有重要指导意义，还有待深入研究。在脾脏和肾脏细胞中溶酶体数量增多，可能是机体在抗损伤的过程中产生炎症反应，巨噬细胞吞噬凋亡淋巴细胞使得溶酶体数量增多。

综上所述，在高密度养殖的情况下，黄颡鱼机体抗病力会受到一定的影响，小肠结肠炎耶尔森菌可趁机侵袭鱼体，然后通过肠道黏膜入侵淋巴组织，并通过血液循环进入组织器官。而脾脏和肾脏作为黄颡鱼重要的造血器官和免疫器官，在鱼体抵抗病原菌的过程中组织结构受到严重的损伤。因此，进一步探讨小肠结肠炎耶尔森菌对黄颡鱼其他组织的病理变化，这对深入研究该菌感染黄颡鱼的致病机理和疾病的准确诊断具有重要意义。

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