犬细小病毒JL-M13株的分离鉴定及全基因组序列分析

仝明薇，易 立，程世鹏

（中国农业科学院特产研究所，吉林长春 130112）

犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染幼犬引起的一种急性传染病，发病率高，传染性强，病程短，病死率高［1-4］，是危害我国犬养殖业最严重的传染病之一，可造成相当大的经济损失。犬细小病毒于1978年由美国学者从犬粪便样品中首次分离获得［5］。1982年梁士哲和徐汉坤相继报道了国内的犬细小病毒流行情况。细小病毒属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus）［6］，病毒粒子在电镜下呈圆形或六边形，无囊膜，核衣壳为轴对称的20面体。细小病毒为线状单股负链的DNA病毒，基因组含有5 323个核苷酸［7］。在抗原性上与非致病性微小病毒（Minute virus of canine，MVC）有显著差异，而被命名为 CPV-2［8］。CPV 只有一个抗原型，即 CPV-2，在其出现后不断发生抗原漂移，目前已有多个亚型，分别为 CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）及 CPV-2c（b）［9-11］。

由于CPV具有很快的变异速度，现在临床使用的灭活疫苗与弱毒疫苗的免疫效果都有不同程度下降。因此，针对当前流行的CPV毒株进行研究分析，为制备更有效的疫苗奠定一定的理论基础，对防控犬细小病毒病，促进犬养殖业健康发展具有重要意义。本研究根据GenBank中已登录的CPV序列，利用重叠PCR技术从CPV分离株中提取的DNA，并进行了生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 试验用病料为吉林省长春市某犬养殖场疑似细小病毒症状犬的粪便，收集病料共16份，置-80℃保存备用。。

1.1.2 主要试剂 StoolGen DNA Kit、Universal DNA Purification Kit为康为世纪生物科技有限公司产品；EsTaqDNA polymerase为 TaKaRa公司产品；F81细胞由中国农业科学院特产研究所重点实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 犬细小病毒分离 取病料（0.2g），用 EMEM细胞营养液10倍稀释，上下颠倒充分混匀，5 000r／min离心20min，取上清，经0.22μm 微孔滤膜过滤后，置-20℃冻存备用。将处理好的样品按培养液体积的1／10接种于F81细胞系（由本实验室保存），同时设正常细胞对照，37℃吸附30min，加生长液继续于37℃、体积分数为5%CO2条件下静置培养4d～5d，每天观察细胞贴壁生长情况及有无细胞病变。如无病变则于培养的第4d～5d收取上清，细胞继续按常规传代培养，至第5代仍无病变视为分离阴性；出现细胞病变的经-20℃／37℃反复冻融3次收毒，置-20℃保存。

1.2.2 病毒基因组DNA的提取 病料DNA提取参考Stool Gen DNA Kit，提取的 DNA 用无核酸酶的水溶解，置-20℃保存。

1.2.3 犬细小病毒部分基因片段的PCR扩增 参照GenBank上已登录的犬细小病毒（登录号为：EU310373）基因组保守区应用Premier 5.0设计一对引物：上游引物：5′-ATCTGAGACATTGGGTTT-3′，下游引物：5′-TTTCTAGGTGCTAGTTGA-3′。两个引物间理论的PCR产物为1 105bp，由Invitrogen（上海）公司合成。PCR采用25μL反应体系：10×buffer 2.5μL，dNTPs 2μL、上、下游引物各1μL，EsTaq酶0.5μL，模板2μL，ddH2O 16μL，95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min 15s，30个循环；最后72℃8min。反应结束后，经10g／L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.2.4 克隆片段的序列测定 将PCR产物送Invitrogen公司（上海）进行测序分析。随后利用Gen-Bank中的Blast分析软件包对测序结果进行序列分析，以确定所扩增序列为犬细小病毒基因组序列。

1.2.5 犬细小病毒全基因组序列重叠PCR扩增根据克隆片段的测序结果，设计了5对引物（图1）用于克隆病毒基因组的全基因序列。引物序列分别如下：P1：5′-GTGGCGGGCTAATTGTGG-3′；P2：5′-TGTTTGCTTATGTCTGTATGTT-3′； P3： 5′-GGTGACTCTTTGTTCGGTAA-3′；P4：5′-GCTTGTGCTATGGCTTGA-3′；P5：5′-ACGGATGGAATTGGATTA-3′；P6：5′-ACCAGAGCGAAGATAAGC-3′；P7：5′-CGCTGCTTATCTTCGCTCTG-3′；P8：5′-TTCATCTGTTTGCGCTCCC-3′；P9：5′-CTCAAATGGGAAATACAAAC-3′； P10： 5′-ATTCTAAGGGCAAACCAA-3′

图1 病毒基因组全序列重叠PCR引物简图Fig.1 The map of overlapping PCR primers of virus genome

5对引物间理论的PCR产物分别为696、771、1 133、1 396、1 045bp。PCR采用50μL反应体系：10×buffer 5μL，dNTPs 5μL，上、下游引物各2μL，EsTaq酶 0.5 μL，模 板 4 μL，ddH2O 31.5μL，95℃5min；94℃30s，50℃30s，72℃1min 30s，35个循环；最后72℃8min。反应结束后，经10g／L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并在紫外灯下切割目的片段，然后用Universal DNA Purification Kit回收试剂盒进行回收和纯化，并送Invitrogen公司（上海）进行测序分析。

1.2.6 病毒基因组测序结果的整理与分析 将所获得的5次测序结果用DNA Star软件包中的Editseq、Seqman等程序进行整理、校对，并拼接成线性全基因组序列，最后运用分子生物学软件分析该病毒基因组与细小病毒科其他病毒的基因组遗传变异情况等。

2 结果

2.1 犬细小病毒分离

将采集的病料接种于F81细胞，应用同步接毒和带毒传代的方法分离获得了1株犬细小病毒，命名为JL-M13。与正常细胞（图2A）相比，JL-M13在F81细胞连续传代3次即出现明显CPE，表现为细胞肿胀变大，细胞融合成圆形或椭圆形大融合细胞，细胞间隙变大并成“拉网状”（图2B）。

图2 细胞观察结果Fig.2 The results of cell observation

2.2 病毒基因组部分片段的PCR扩增

病毒基因组部分片段的PCR产物经10g／L的琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统观察到一条大小约1 105bp左右的条带，与预期结果相符。测序后经Blast分析，发现与GenBank中犬细小病毒CPV-2毒株（EF011664.1）的同源性高达99.6%，利用测序结果设计5对引物，扩增病毒基因组全基因序列，经10g／L的琼脂糖凝胶电泳后得到大小分别约为696、771、1 133、1 396、1 045bp 的条带，与预期结果相符（图3），PCR产物经回收纯化后直接进行测序。

2.3 病毒基因组的测序结果及分析

将5次测序结果运用分子生物学软件拼接后表明，该病毒基因组全长4 621bp，分析表明，JL-M13为Type-2型细小病毒。基因组包含2个ORF。ORF1编码2种非结构蛋白（NS1和NS2），ORF2编码2种结构蛋白（VP1和VP2）。

2.4 病毒基因组的遗传变异分析

图3 JL-M13病毒基因组部分片段的PCR产物Fig.3 PCR products of viral genome of JL-M13strain

利用生物学软件，对所获得细小病毒JL-M13毒株与GenBank数据库中细小病毒参考毒株的基因组构建进化树表明（图4），本研究中所获的JL-M13毒株与CPV-2-SC02／2011毒株和CPV-s5毒株同属于CPV-2型，并在拓扑结构上与四川株SC02／2011非常接近，这暗示本次获得的犬细小病毒毒株与四川流行株SC02／2011有着极其紧密地关系。

将该病毒基因组与细小病毒科中其他细小病毒基因组进行比对发现，从不同动物中分离得到的细小病毒，其同源性差异较大。所获的JL-M13毒株与番鸭细小病毒（MPV）同源性最低，为30.8%；与猪细小病毒（PPV）和牛细小病毒（BPV）的同源性也较低，为33.8%～41.3%；与鼠细小病毒（MMV）同源性为66.2%；与猫泛白细胞减少症病毒（FPV）、貂肠炎病毒（MEV）、犬细小病毒（CPV）的同源性均在98.0%以上，其中与病毒株CPV-2同源性高达99.6%（图5）。

图4 JL-M13病毒基因组遗传进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of JL-M13virus genome

图5 JL-M13病毒基因组同源性分析Fig.5 Homological analysis of JL-M13genome

3 讨论

细小病毒由于自身所带基因限制，其复制增值病毒前期所需的酶均要宿主细胞的帮助，这就要求宿主细胞必须处于对数生长期，故细小病毒培养多采用同步接毒的方法。本研究所获的细小病毒毒株（JL-M13），全长4 621bp，包括2个 ORF，ORF1编码两种非结构蛋白（NS1和NS2），ORF2编码两种结构蛋白（VP1和VP2），这与其他细小病毒类似。将JL-M13毒株与GenBank数据库中细小病毒参考毒株的基因组构建进化树表明，该毒株属于CPV-2型，并与2011年分离的四川株SC02／2011有较密切的关系，这是否暗示着近年来犬细小病毒由南至北的流行还有待进一步研究。

病毒基因组同源性分析表明，从不同动物中分离得到的细小病毒，其核苷酸同源性差异很大。JLM13，与番鸭细小病毒同源性最低，为30.8%；与猪细小病毒、牛细小病毒和鼠细小病毒的同源性也较低，为33.8%～66.2%；与猫泛白细胞减少症病毒、貂肠炎病毒、犬细小病毒的同源性均在98.0%以上，其中与病毒株CPV-2同源性高达99.6%。由此可见细小病毒在不同动物间有较为严格的种属特性。

细小病毒自1978年由美国学者首次分离报道后，已不断在抗原性、宿主范围和血凝性等方面发生变异，并已出现多个亚型。其感染宿主也由主要感染犬科动物到已证实的CPV-2a、CPV-2b在自然条件下也能感染猫科、鼬科等多种肉食兽［12］。CPV-2a、CPV-2b被发现后很快取代了最初的CPV-2，二者一般呈混合感染，而应用单克隆抗体发现的CPV-2c［13］与 CPV-2a、CPV-2b一样，也在世界范围广泛分布，并有逐渐取代其他型的趋势。我国的CPV分离株没有形成明显的中国CPV分支，在中国台湾，先前的报道CPV-2a占优势地位，WANG H G等［1］研究发现在台湾中部却以CPV-2b为主。易立等2009年研究报道，武汉、南京和北京等城市宠物犬中流行的犬细小病毒CPV-2a亚型毒株单独构成一簇，并且与2008年的韩国分离株K001关系紧密，而与早期其他地区的犬细小病毒CPV-2a亚型流行株距离较远，预示着犬细小病毒流行株的变异具有某种时间和空间相关性。本研究对犬细小病毒流行毒株的基因组序列及其变异规律，同源性等进行分析，为生产实践中免疫失败寻找原因提供基础，为有针对性地采取有效的防控措施，积极防控该病提供重要参考。

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