新疆不同动物源大肠埃希菌耐药性比较

底丽娜，赵红琼，夏利宁，南海辰

（新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

新疆是我国牛羊重要养殖地区，受宗教信仰和消费习俗的影响，牛羊肉的消费具有一定的刚性需求和不可替代性，养猪业也占着重要的比重。然而，面临养殖集约化程度低，官方兽医制度不完善，治疗用药混乱，随之而来的临床耐药性问题也日趋严重，已成为制约畜牧业发展的重要因素。喹诺酮类、β－内酰胺类、氨基糖苷类及酰胺醇类药物具有杀菌谱广、快速杀菌等优点，广泛用于临床，为动物疾病的预防和治疗做出贡献。随着临床对上述药物的广泛应用，研究者发现细菌对这几类药物的耐药性呈逐年升高的趋势［1］。动物源细菌耐药性的迅速出现，不仅使得原有的抗菌药物失去作用，导致动物疾病难以控制，而且这些耐药菌极有可能通过污染食品和环境或动物与人的接触过程中传递给人，对人类的健康构成威胁［2］。本研究以新疆猪场、羊场和牛场代表不同来源的猪、羊、牛的粪样中分离的大肠埃希菌作为研究对象。用微量肉汤法对上述菌进行临床常用抗菌药物的最小抑菌浓度测定；分析比较不同动物源大肠埃希菌耐药和多药耐药情况，阐明大肠埃希菌耐药性与临床用抗菌药物的相关性，对指导临床合理使用抗菌药物及耐药性监测工作的开展具有实际意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株 2010年9月自新疆某规模化猪场（养殖场分布于呼图壁和昌吉等地）采集猪肛拭粪样分离出猪源大肠埃希菌454株。2010年9月自新疆昌吉某规模化羊场采集羊肛拭粪样分离出羊源大肠埃希菌638株。2012年9月～10月自新疆南北疆牛场采集牛肛拭粪样分离出牛源大肠埃希菌89株。标准质控菌大肠埃希菌ATCC25922为杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.2 培养基 麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、普通肉汤和Mueller－Hinton（MH）培养基为北京奥博星生物技术有限公司产品。

1.1.3 试验药品 喹诺酮类：环丙沙星（含量100%）、诺氟沙星（含量99.6%）和恩诺沙星（含量100%）；β－内酰胺类：头孢噻呋（含量100%）、氨苄西林（含量86.5%）和阿莫西林（含量86.6%）／克拉维酸（含量100%）；氨基糖苷类：安普霉素（含量55.8%）、阿米卡星（含量65.5%）、庆大霉素（含量54.6%）；酰胺醇类：氟苯尼考（含量99.2%）。上述药品均为标准品，为中国兽医药品监察所产品。

1.2 方法

1.2.1 大肠埃希菌分离鉴定方法 按临床常用细菌分离鉴定方法，将采集的沾有样品的肛拭子放入内含1mL灭菌营养肉汤的2mL EP管中，恒温培养箱内37℃培养12h，用接种环将样液在伊红美蓝琼脂平板上划线，恒温培养箱内37℃培养18h～24h后，挑取平板上紫黑色、有金属光泽的单菌落，在麦康凯琼脂平板上划线，置于恒温培养箱内37℃培养18h～24h后，平板上生长出一致的粉红色菌落，为大肠埃希菌，挑取单菌落，保存备用。疑似菌株经革兰染色及生化鉴定后，确定为大肠埃希菌的保存备用。

1.2.2 大肠埃希菌药敏试验及其判定方法 根据对各养殖场进行用药调研，选取各养殖场常用抗菌药物进行药敏试验，其中猪源与羊源菌未进行氨基糖苷类庆大霉素的测定，而是选取酰胺醇类氟苯尼考测定，牛源相反。按CLSI推荐的微量肉汤稀释法进行，对分离的不同动物源大肠埃希菌进行上述药物的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）值测定，结果判定参照美国临床实验室标准委员会CLSI标准。以ATCC25922菌株作为标准质控，其对被检抗菌药物的MIC均在质控范围内，且阳性对照肉汤长菌，阴性对照肉汤清亮，MIC结果真实可信。判断结果分别以敏感、中介和耐药3种形式记录结果，具体判断标准见表1［3－4］。

表1 抗菌药物的MICs结果判定标准Table 1 The MICs criteria of antimicrobial agents μg／mL

2 结果

2.1 大肠埃希菌的分离鉴定结果

大肠埃希菌是共生菌，易于分离，大肠埃希菌分离率见表2。从猪场采集的543份粪样中分离出454株大肠埃希菌（83.6%），从羊场采集的780份粪样中分离出638株大肠埃希菌（81.8%），从牛场采集的90份粪样中分离出89株大肠埃希菌（98.9%）。其中牛粪样分离率最高。

表2 不同动物源大肠埃希菌的分离情况Table 2 The isolation of E.coli in different animals

2.2 药敏试验结果

2.2.1 不同地区动物源大肠埃希菌耐药结果 药敏结果显示，各地区不同动物源大肠埃希菌对常用抗生素均表现出不同程度的耐药，耐药情况各不相同，猪源呼图壁地区耐药情况均较严重，牛源不同地区以昭苏、新合和拜城地区的耐药较为严重，对常用的10种抗生素，各地区猪源与牛源大肠埃希菌均对氨苄西林耐药较为严重，羊源大肠埃希菌对安普霉素的耐药较高（表3）。

2.2.2 不同动物源大肠埃希菌耐药率结果比较由图1可知，猪源大肠埃希菌对氨苄西林、阿莫西林／克拉维酸、氟苯尼考和恩诺沙星的耐药较为严重，耐药率均在40%以上；羊源大肠埃希菌对安普霉素和阿莫西林／克拉维酸耐药率较高，分别为33.9%和21.2%；牛源大肠埃希菌对氨苄西林耐药率较高为24.4%，对其他被检抗生素的耐药率都在10%以下。

2.2.3 不同动物源大肠埃希菌中介率结果比较由图2可知，猪源大肠埃希菌对恩诺沙星的中介率较高为25.8%，对氨苄西林的中介率仅1.1%，对其他被检抗菌药物的中介率均在5%左右；羊源大肠埃希菌对氨苄西林、阿米卡星和恩诺沙星的中介率较高，均在15%以上；牛源大肠埃希菌对阿莫西林／克拉维酸的中介率较高仅10.0%、对其他被检药物的中介率均在3%以下，被检药物中安普霉素、氟苯尼考、庆大霉素无中介值。

2.2.4 不同动物源大肠埃希菌敏感率结果比较由图3可知，猪源大肠埃希菌对头孢噻呋、阿米卡星、环丙沙星的敏感率均在70.0%以上；羊源大肠埃希菌对氟苯尼考、诺氟沙星、头孢噻呋、环丙沙星的敏感率分别为96.9%、88.9%、84.5%、81.3%，均在80.0%以上；牛源大肠埃希菌对安普霉素、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星、阿米卡星、庆大霉素、头孢噻呋、阿莫西林／克拉维酸、氨苄西林敏感率依次为：98.9%、97.8%、97.8%、97.8%、97.8%、95.6%、92.2%、81.1%和72.2%。

2.2.5 不同动物源菌多药耐药结果 由图4可知，猪源大肠埃希菌2耐～5耐为主，占78.2%，多药耐药菌株中以3耐（20.7%）居多，0耐不足10%，9耐菌株占0.2%；羊源大肠埃希菌以0耐～2耐为主，占79.9%，0耐菌株占34.3%，仅1株9耐（0.2%）菌株；牛源大肠埃希菌0耐～1耐为主，占90.0%，0耐（64.4%）居多，仅1株（1.1%）5耐菌株。

表3 不同地区动物源大肠埃希菌耐药结果Table 3 The drug resistance results of E.coli in animals of different districts

图1 不同动物源大肠埃希菌对临床常用抗菌药物耐药情况Fig.1 The antimicrobial drug resistance of E.coli isolates from different animals

图2 不同动物源大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的中介情况Fig.2 The antimicrobial drug resistance intermediary of E.coli isolates from different animals

图3 不同动物源大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的敏感情况Fig.3 The antimicrobial drug sensitiveities of E.coli isolates from different animals

图4 不同动物源大肠埃希菌对临床常用抗菌药物多重药耐药情况Fig.4 The multidrug resistance of E.coli isolates from different animals

2.2.6 不同动物源菌耐药分型结果 结果见表4。猪源大肠埃希菌对所检测的9种抗菌药物存在148种耐药表型，多药耐药菌株中以 A／C／AMP／FFC（35株）、A／C／AMP（28株）、AMP（14株）表型居多，羊源大肠埃希菌对所检测的9种抗菌药物存在101种耐药表型，多药耐药菌株中以APR（62株）、AMK（44株）、APR／AMK（40株），牛源大肠埃希菌对所检测的9种抗生素存在11种耐药表型，多药耐药菌株中以 AMP（14株）、A／C／AMP（4株）表型居多。

3 讨论

3.1 不同动物源大肠埃希菌对被检药物耐药情况比较

不同动物源大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的敏感实验结果显示，除氨苄西林外，对临床常用抗菌药物的耐药率呈猪源菌＞羊源菌＞牛源菌，值得注意的是猪源菌对于使用时间不长的动物专用广谱抗生素氟苯尼考耐药率已达41.2%。对阿米卡星的耐药率已达到19.8%，阿米卡星为半合成的氨基糖苷类药物，对多数氨基糖苷类钝化酶稳定［5］，因其价格高，兽医临床用药频率低，然而已经产生不可小觑的耐药率；中介结果可以看出，猪源大肠埃希菌对喹诺酮类药物恩诺沙星的中介率最高，而羊源菌在β－内酰胺类氨苄西林及氨基糖苷类药物阿米卡星的中介值也都较高，提示如继续使用该类药物在短期内可能有升高的风险，迅速增加对该药耐受的细菌数量，致使该类药物临床治疗失败；通过敏感性比较可知，牛源菌对被检共同药物的敏感性显著高于猪源菌与羊源菌，敏感率较高的抗菌药物提示在未来使用中占优势，或起到好的治疗作用。牛源菌对此次单独检测的庆大霉素的敏感性显著高于其他动物源［6－7］。

我国各地区对于猪源大肠埃希菌耐药性检测较多，不同地区耐药情况有相当大的差异。戴秀美等［8］对我国不同地区猪源大肠埃希菌耐药性进行统计，广东对阿莫西林、氨苄青霉素、庆大霉素耐药率为100%；湖南猪源大肠埃希菌对恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、头孢噻呋、安普霉素和庆大霉素的耐药率分别为86.2%、72.4%、74.1%、51.7%、5.2%和63.8%；哈尔滨猪源大肠埃希菌对恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林／克拉维酸、氨苄西林、头孢噻呋和庆大霉素的耐药率分别为 76.3%、68.8%、97.5%、97.5%、81.3%和62.5%。此外，四川、皖西地区等全国大部分地区猪源大肠埃希菌对抗菌药物耐药程度明显高于新疆猪源大肠埃希菌。与猪源，牛源大肠埃希菌耐药程度调查较少，余婷等［9］报道宁夏地区66株牛源大肠埃希菌对庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、诺氟沙星、恩诺沙星耐药率分别为40.9%、15.2%、6.1%、7.6%和19.7%，其耐药率高于本次被检药物；薛原等［10］报道哈尔滨地区48株奶牛源大肠埃希菌对阿莫西林／克拉维酸钾的耐药率达97.92%，庆大霉素耐药率＞10%，均高于本次所检药物，安普霉素耐药率与本次被检相近。羊源菌的耐药调查鲜见报道，本次仅对某一养殖场进行羊源大肠埃希菌耐药初探，采集数量较多，有一定的局限性，仅代表该养殖的耐药情况。今后需进一步扩大样品采集的范围和数量，从而更加全面地反应新疆动物源大肠埃希菌的耐药水平。

表4 不同动物源大肠埃希菌主要的耐药表型Table 4 The main drug resistance phenotype of E.coli isolates from different animals

3.2 不同动物源大肠埃希菌对被检抗菌药物多药耐药性比较

通过多药耐药比较可知，对临床常用抗菌药物的多药耐药水平呈猪源菌＞羊源菌＞牛源菌。不同动物源多药耐药表型分型结果显示，猪源大肠埃希菌耐药分型主要以3耐为主，耐药分型复杂，含有148种耐药表型，羊源大肠埃希菌耐药分型主要以2耐为主，牛源大肠埃希菌耐药分型主要以1耐为主，此外，猪源和牛源大肠埃希菌耐药分型都以AMP、A／C／AMP、A／C／AMP／FFC分型较多，羊源大肠埃希菌主要以APR、AMK、APR／AMK分型较多，不同动物源大肠埃希菌多药耐药表型复杂，造成这种现象产生的原因可能是菌株长期处于多种抗菌药物的选择压力下，致使细菌的耐药性通过染色体或质粒介导在细菌间传播和扩散，致使正常大肠埃希菌对药物环境的适应性增强，不同耐药基因在细菌间的相互传递和蔓延，因而可导致多药耐药性广泛流行。另据研究报道，多药耐药菌株的大量出现，可能是菌体细胞膜通透性的改变和细菌主动外排系统的超量表达共同作用的结果［11］。多药耐药性的增加必然会导致联合用药的效果降低，从而影响临床治疗效果，增加治疗成本。

就新疆本地而言，猪源、羊源和牛源大肠埃希菌对被检抗菌药物的耐药性有较大差异。根据用药调查发现，猪在免疫接种时或感染寄生虫时持续使用抗菌药物，且饲料中常常添加抗菌药物来促生长和预防疾病。而对于牛羊养殖，新疆集约化养殖程度低，多采用放牧和舍饲，自然抵抗力较强，用药少且频率低，有文献报道［12］自然放牧的畜牧业比集约化养殖场的耐药情况要低，自由放牧和减少抗菌药物的使用可能在某种程度上减少抗菌药物耐药的发生。另外，牛的兽医临床常采用有较好治疗效果的物理疗法或中药控制疾病（如乳房炎等）［13］。本试验结果与国内许多研究结果存在一定的相似性，与我国大部分地区一样，新疆猪源、羊源、牛源大肠埃希菌对临床上长期使用的氨苄西林、阿莫西林／克拉维酸的耐药率较高。有研究表明［14］细菌的耐药性与抗菌药物选择压力密切相关，随着抗菌药物选择压力的增强，无论是大肠埃希菌对抗菌药物的耐药率还是多药耐药率都在不断增大。抗菌药物的用量和频率的不同是引起动物源大肠埃希菌耐药差异的重要原因。

因此，有必要对大肠埃希菌进行定期的药物敏感性监测，实时追踪和掌控大肠埃希菌的耐药性，以便制定合理的用药方案，以最大限度的降低细菌耐药率和延长抗菌药物的疗效周期。临床治疗细菌性疾病时，应考虑停用动物已经产生耐药的药物，更换其它敏感的抗菌药物作为治疗药物。对于某些中介率较高的药物，用药时要有足够剂量和疗程。兽医临床中，还要注意交叉用药或联合用药，不能一味使用新药，也可适时选择中兽药或食疗等方法来代替传统的治疗方法。此外，应当加强日常饲养管理，改善卫生条件，提前做好预防接种。

新疆不同动物源大肠埃希菌对临床常用抗菌药物的耐药性呈现不同程度的耐药，但总体低于我国其它地区耐药水平，猪源大肠埃希菌对临床常用抗菌药物耐药情况最严重，羊源菌次之，牛源菌耐药水平最低。

猪源大肠埃希菌多药耐药现象严重，猪场应慎重使用上述被检各类抗菌药物。

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