三种佐剂对奶山羊乳房炎灭活疫苗免疫效果的影响

侯伟杰，高 洋，高晶晖，安 贝，张淼涛，陈德坤

（西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）

乳房炎是奶山羊养殖业中流行面广、造成损失最大的疾病之一。调查数据显示，目前我国奶山羊隐性乳房炎的检出率约为43%左右［1］，其不仅会降低乳产量，还会严重影响乳品质［2］。相对于奶牛乳房炎病原菌的复杂性，奶山羊乳房炎的病原菌主要为大肠埃希菌（占18%）、金黄色葡萄球菌（占15%）、表皮葡萄球菌（占26%）及产色葡萄球菌（占20%）［3］，因此可利用此4种细菌制备疫苗进行奶山羊乳房炎的防控。大量研究显示，免疫佐剂是疫苗的关键组成部分，通过合理有效安全的使用佐剂，可以增强抗原的免疫原性，增强宿主对抗原的保护性应答。常用的免疫佐剂主要包括铝胶盐、蜂胶、转移因子等，这些佐剂可通过参与抗原递呈、免疫调节等方式促进免疫应答。本研究以奶山羊乳房炎的主要病原菌为材料制备了乳房炎灭活苗，并探讨了铝胶盐、蜂胶和转移因子佐剂的促进免疫应答作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 陕西富平县第一养殖小区的处于泌乳期的萨能奶山羊。

1.1.2 菌株 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性产色葡萄球菌、凝固酶阴性表皮葡萄球菌，均为西北农林科技大学兽医免疫学实验室分离鉴定保存的奶山羊乳房炎病原菌。

1.1.3 主要试剂及培养基 转移因子为西北农林科技大学兽医免疫学实验室制备、保存的猪脾脏转移因子；蜂胶；LB液体培养基；辣根过氧化物酶标二抗（兔抗羊IgG－HRP）；可溶性单组分TMB 底物溶液及蛋白定量试剂盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；奶山羊隐性乳房炎诊断液由西北农林科技大学兽医免疫学实验室制备（配方获发明专利，授权号：ZL 200910024340.7）；氯化钠；硫酸铝钾；氢氧化钠；无水乙醇；吐温－80等。

1.2 方法

1.2.1 细菌悬液制备 将菌株分别接种LB 液体培养基，振荡培养12h～16h后用平板菌落计数法计数，分别调整细菌浓度为产色葡萄球菌和表皮葡萄球菌为5×109CFU／mL，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌终浓度为2.5×109CFU／mL。

1.2.2 细菌灭活 向调整好浓度的菌液中加入终浓度为3mL／L 的甲醛溶液，大肠埃希菌振荡灭活48h，葡萄球菌振荡灭活96h后，取适量菌液涂LB平板，37 ℃培养24h，观察平板有无菌落形成。

将灭活好的菌液12 000r／min离心5min，弃上清、收集菌体沉淀。

1.2.3 疫苗的制备 将灭活的产色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌按照其在隐性乳房炎乳汁中的比例混合，得到混合菌泥。

铝胶盐佐剂疫苗的制备：菌泥与实验室制备的铝胶盐佐剂按6∶1（V／V）充分混匀，4 ℃保存备用。

转移因子佐剂疫苗的制备：混合菌泥用适量转移因子重悬，4 ℃保存备用。

蜂胶佐剂疫苗的制备：取适量蜂胶溶解于950mL／L的酒精，使蜂胶浓度为1 000 mg／mL，然后取此浓度蜂胶与吐温80按体积比1∶4混匀，最后用混合液重悬菌泥。蜂胶终浓度为20 mg／mL，吐温80终浓度为10%。

3种佐剂疫苗中，产色葡萄球菌和表皮葡萄球菌浓度为5×109CFU／mL，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌终浓度为2.5×109CFU／mL。

1.2.4 免疫试验 免疫前，用隐性乳房炎快速诊断试剂对泌乳期的112只奶山羊进行普查。根据普查结果，将奶山羊进行如下分组：10 只乳房炎阴性奶山羊作为对照组，试验中不作任何处理。另外102只奶山羊分成3组：铝胶盐组35只，转移因子组33只，蜂胶组34 只。免疫接种时，3 个组的免疫剂量均为2mL／只，免疫部位为颈部皮下免疫。第一次免疫接种后14d，以同样剂量和部位再进行免疫接种。

1.2.5 样本采集 在免疫前及第一次免疫和第二次免疫后的第10天采集所有羊的乳汁和血液样本。分离乳清和血清，保存于－20 ℃用于后续测定。

1.2.6 抗体效价测定 用间接ELISA 方法［4］测定乳汁和血液样本中各菌病原菌抗体效价。P／N≥2.1判为阳性，否则判定为阴性。

1.2.7 隐性乳房炎检测 分别在免疫前、一免后10d，二免后10d用奶山羊隐性乳房炎诊断液对各免疫组和对照组奶山羊进行检测，并统计检出率。采用Graphpad5 软件进行数据检测分析。

2 结果

2.1 细菌灭活效果

大肠埃希菌灭活48h，葡萄球菌灭活96h后，取100μL 菌液涂LB 平板，37 ℃，培养24h后，观察，平板上无菌落形成，表明细菌灭活彻底。

2.2 乳中各病原抗体测定结果

同对照组相比，蜂胶组在一免和二免后，表皮葡萄球菌抗体效价均显著升高（P＜0.05），大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和产色葡萄球菌抗体效价均升高，但与对照组相比无显著性差异；转移因子组中，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抗体效价在两次免疫后均显著高于对照组（P＜0.05），产色葡萄球菌抗体在第二次免疫后显著高于对照组（P＜0.05）；铝胶盐组同对照组相比，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和产色葡萄球菌抗体效价在一免后均显著增加（P＜0.05），二免后，增加更显（P＜0.01）（图1～图4）。

图1 不同免疫佐剂大肠埃希菌乳清抗体效价Fig.1 E.coli antibody titers of different adjuvant groups in milk serum

图2 不同免疫佐剂金黄色葡萄球菌乳清抗体效价Fig.2 S.aureus antibody titers of different adjuvant groups in milk serum

图3 不同免疫佐剂表皮葡萄球菌乳清抗体效价Fig.3 S.epidermidis antibody titers of different adjuvant groups in milk serum

图4 不同免疫佐剂产色葡萄球菌乳清抗体效价Fig.4 S.chromolgenes antibody titers of different adjuvant groups in milk serum

2.3 各组血中细菌抗体的测定结果

二次免疫后，同对照组相比，蜂胶组中各菌的抗体效价均增加，但无显著性差异；转移因子组中大肠埃希菌和产色葡萄球菌抗体效价在第一次免疫后就显著高于对照组（P＜0.05），金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌抗体效价则在第二次免疫后显著增加（P＜0.05）；铝胶盐组大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和产色葡萄球菌抗体效价在第一次和第二次免疫后均显著高于对照组（P＜0.05）（图5～图8）。

图5 不同免疫佐剂大肠埃希菌血清抗体效价Fig.5 E.coli antibody titers of different adjuvant groups in serum

图6 不同免疫佐剂金黄色葡萄球菌血清抗体效价Fig.6 S.aureus antibody titers of different adjuvant groups in serum

图7 不同免疫佐剂表皮葡萄球菌血清抗体效价Fig.7 S.epidermidis antibody titers of different adjuvant groups in serum

图8 不同免疫佐剂产色葡萄球菌血清抗体效价Fig.8 S.chromolgenes antibody titers of different adjuvant groups in serum

2.4 隐性乳房炎检出结果

在整个试验过程中，对照组的奶山羊隐性羊乳房炎均未检出。在第一次免疫后，蜂胶组隐性乳房炎检出率在整个试验过程中基本无变化，保持在65%左右；转移因子组的隐性乳房炎检出率在第一次免疫后，由免疫前的62.8%下降至54.8%，在第二次免疫后检出率为55.2%，基本与第一次免疫后持平；铝胶盐组隐性乳房炎检出率在首次免疫后下降趋势明显，由免疫前60%迅速下降为34.5%，第二次免疫后又下降至30%。结果表明，转移因子佐剂疫苗和铝胶盐佐剂疫苗对隐性乳房炎均有治疗作用，其中铝胶盐佐剂疫苗的治疗作用更显著（图9）。

图9 不同免疫佐剂组隐性乳房炎检出率统计Fig.9 Detection rate of subclinical mastitis in different adjuvant groups

3 讨论

奶山羊乳房炎的主要病原菌包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌及产色葡萄球菌［3］，均为细胞外寄生菌。大量的研究表明，体液免疫应答在清除胞外菌感染中具有重要意义。灭活疫苗对胞外寄生菌具有较好的免疫效果，其激发的体液免疫应答中产生的抗体，在乳腺抵抗病原菌的感染中具有重要的作用，包括对细菌繁殖的抑制作用，对细菌的溶解作用及调理吞噬作用等，乳腺组织内抗体浓度及活性的变化可直接影响疾病的发生。因此，本研究以此4种菌为材料制备了灭活疫苗。

铝胶盐是目前在人类及动物上唯一被批准使用的无机物类佐剂，可通过对抗原的吸附作用增强机体免疫应答［5］，其中主要是诱导机体的体液免疫应答，研究显示，铝胶盐佐剂能通过诱导NLRP3炎性小体的活化来促进IL－18、IL－33和PGE2的释放，释放的这些细胞因子会促进TH2 型细胞因子（比如IL－4、IL－5和IL－13）的产生，从而促进TH2 型免疫应答［6］，另外铝胶盐还能通过显著增加机体的免疫球蛋白IgE（小鼠和人）［7－8］来促进免疫应答；目前蜂胶中已经发现的生物活性物质超过300种，其中的很多生物活性物质都具有广泛的免疫调节作用，包括促进T 细胞增殖及增强T 细胞活性等，增强机体免疫功能［9］，推测蜂胶的佐剂作用很可能是通过蜂胶中各成分的协同作用而发挥的［10］；转移因子能刺激机体产生高水平的IFN－γ，增强细胞免疫应答［11］，并且无任何毒副作用，研究显示牦牛脾脏转移因子对小鼠脾淋巴细胞增殖有促进作用［12］。本研究选用处于泌乳期的奶山羊作为研究对象，通过不同免疫佐剂的奶山羊乳房炎灭活苗免疫试验，探讨了铝胶盐佐剂、蜂胶佐剂和转移因子佐剂的免疫促进作用。结果显示，本研究中所制备的蜂胶佐剂疫苗的免疫效力较低，刺激机体产生的抗体水平与对照组相比无显著性差异，隐性乳房炎检出率也无明显变化；转移因子佐剂疫苗具有一定的免疫效力，同对照组相比，各病原菌抗体效价在第2次免疫后有显著增加（P＜0.05），隐性乳房炎检出率在免疫后稍有下降，说明转移因子佐剂疫苗对患隐性乳房炎的奶山羊具有一定的治疗作用；胶盐佐剂疫苗免疫效力最强，免疫铝胶盐佐剂疫苗的奶山羊，机体针对各病原菌的抗体效价在首免和二次免疫后均显著增加（P＜0.05），隐性乳房炎检出率显著降低。研究表明同蜂胶和转移因子相比，铝胶盐佐剂能刺激机体产生更强的体液免疫应答，对隐性乳房炎的治疗效果更显著。

［1］ 姚运亮.我国奶山羊主要养殖省份隐性乳房炎的调查及病原菌多重PCR 检测方法的建立［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学，2013.

［2］ 郭 军，刘艳辉，李翠枝.乳及乳制品的抗生素和其他兽药残留问题［J］.中国乳品工业，2004，32（9）：28－32.

［3］ 姚运亮，田婷婷，许君艳，等.关中奶山羊隐性乳房炎病原菌的分离鉴定［J］.动物医学进展，2013，34（4）：116－119.

［4］ 侯伟杰.奶山羊乳房炎灭活疫苗的制备及其免疫效果评估［D］.陕西杨凌：西北农林科技大学，2014.

［5］ Lu Fangjia，Boutselis L，Borch R F，et al.Control of antigenbinding to aluminum adjuvants and the immune response with a novel phosphonate linker［J］.Vaccine，2013，31（40）：4362－4367.

［6］ Terhune T D，Deth R C.How aluminum adjuvants could promote and enhance non－target IgE synthesis in a genetically－vulnerable sub－population［J］.J Immunotoxicol，2013，10（2）：210－222.

［7］ Shang X，Armstrong J，Yang G，et al.Regulation of antigenspecific versus by－stander IgE production after antigen sensitization［J］.Cell immunol，2004，229（2）：106－116.

［8］ Yamanishi R，Yusa I，Bando N，et al.Adjuvant activity of alum in inducing antigen specific IgE antibodies in BALB／c mice：a reevaluation［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2003，67（1）：166.

［9］ 李成山，苏运芳，屈延延，等.蜂胶对小鼠T 细胞亚群及主要相关细胞因子分泌的影响［J］.动物医学进展，2011，32（3）：17－20

［10］ 王 凯，何天俊，胡福良.蜂胶佐剂在受用疫苗中的应用［J］.动物医学进展，2013，34（10）：111－115.

［11］ Wang R N，Wang Y B，Geng J W，et al.Enhancing immune responses to inactivated porcine parvovirus oil emulsion vaccine by co－inoculating porcine transfer factor in mice［J］.Vaccine，2012，30（7）：5246－5252.

［12］ 常建军，文 英，李 莉，等.牦牛脾脏转移因子对小鼠脾淋巴细胞转化增殖的影响［J］.中国农学报，2014，30（5）：38－40.