运动对雌性SD 大鼠卵巢和血清中超氧化物歧化酶的影响

刘 龙

（郑州大学体育学院，河南郑州 450044）

超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）作为细胞中的一种抗氧化酶，在生物体清除氧自由基方面发挥着重要作用。氧自由基在生物体内如果堆积过多，会造成细胞膜上脂质发生过氧化，脂质过氧化会导致细胞膜的正常结构和功能遭到破坏，并进一步会导致蛋白质的交联和变性，导致生物体内许多酶类和激素失去活性。氧自由基堆积过多还会破坏核酸的正常结构。最终使机体代谢出现异常，出现一种退行性的变化，从而导致了衰老现象的发生［1－3］。SOD可以有效清除机体内的有害自由基，及时修复受损伤的细胞和蛋白质，对减缓机体衰老起着很重要的调控作用［4］。研究表明，衰老大鼠睾丸组织中包含SOD在内的一些抗氧化酶活性均显著降低［5］。睾丸组织中含有的SOD含量下降，还会导致细胞内的抗氧化作用和氧化作用之间的平衡出现失调，并最终导致自由基的堆积，加速衰老［6］。适度运动可以通过各种体制提高机体内的SOD含量，从而清除体内的自由基，延缓衰老的发生［7］，运动通过影响外周血和生殖系统器官内SOD的含量对有机体的新陈代谢起着重要的调控作用。

现今关于运动与衰老的试验研究也有一定的报道，但大都侧重于男性生殖系统与衰老的研究，有关适度运动对外周血和女性生殖系统器官组织中SOD的影响及其与衰老的研究至今未见报道。本研究运用免疫组化SP法检测了雌性大鼠卵巢中SOD的表达并进一步检测了大鼠血清中SOD的浓度，为进一步探讨运动与SOD的调控衰老提供了形态学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

健康青春期雌性SD大鼠，体重240g～250g为河南省实验动物中心产品；兔抗鼠SOD多克隆抗体为南京建成生物所产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组 将SD大鼠常规饲养管理，1周后用于试验。并随机分为对照组、20、40、60、80min运动组，共5个试验组。运动形式为游泳，对照组大鼠不运动，试验组大鼠每天分别运动20、40、60、80min。每日进行1次运动，每周运动5d，试验时间为20周。

1.2.2 取材及切片 各试验组训练20周后40mL／L的水合氯霉醛腹腔麻醉处死实验动物，颈动脉取血，制备血清备用。同时取各试验组大鼠卵巢，并迅速置于4℃质量分数为40mL／L的多聚甲醛磷酸缓冲液固定12h～24h后。对固定的卵巢做石蜡切片进行免疫组化染色，切片片厚5μm，取其中的2套。第1套行进行免疫组化SP法染色；第2套用PBS代替一抗，作为对照。

1.2.3 主要试剂及免疫组化操作程序 一抗为兔抗鼠SOD多克隆抗体（1∶100稀释，为武汉博士德生物工程有限公司产品），切片脱蜡复水，按抗体要求和试剂盒操作说明进行免疫组化操作。最后用梯度乙醇脱水干燥后，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照切片染色按照免疫组织化学SP法的染色步骤进行处理，只是把步骤中加入的兔抗大鼠SOD抗体用PBS液代替，其余步骤完全相同，阴性对照用0.01mol／L的PBS缓冲液代替一抗，用DAB显色，然后贴片，进行梯度酒精脱水，用二甲苯透明后置于显微镜下观察。

1.2.4 结果判断及统计学处理 SOD测定时，设空白管（不加亚硝酸钠和标本）、标准管（加入20μmol／L的亚硝酸钠）和测定管，往测定管内加0.3mL的待测血清。各管混匀放置10min后，3 500r／min～4 000r／min离心10min，然后取上清液0.8mL，37℃恒温水浴40min，加入显色剂混匀，10min以后倒入1cm的光径比色杯中，用蒸馏水调零，用酶标仪于波长550nm处比色。并按公式［SOD活力NU／mL（亚硝酸盐单位／mL）＝（A对照管－A测定管）÷A对照管÷50%×稀释液倍数］，计算SOD活力［8］。免疫组化反应中有蓝色颗粒者为阳性，切片中阴性表达的细胞质不显色。图片分析时随机选取10个相同部位不同切片的高倍镜视野（400×），用江苏捷达高清晰的图像分析系统分析，并计算出每一个视野的阳性强度均值（阳性强度均值用平均吸光度表示）和阳性面积，然后计算出相对的表达量μ2均值（μ2＝光镜倍数×阳性强度均值×阳性面积／260 000）［8］，公式中260 000表示像素。最终计量资料应用均值±标准差（¯x±SD）表示，统计学应用SPSS11.5统计软件进行统计分析，用t检验法比较出各组大鼠卵巢中SOD的表达，P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 SOD浓度测定结果

与对照组相比，20min运动训练组与0min运动组相比无显著性差异，80min运动训练组大鼠血清中SOD浓度较低而差异显著（P＜0.05）；40min和60min运动组大鼠血清中SOD的浓度与对照组相比较高而差异显著（P＜0.05）同时，40min运动训练组与60min运动训练组之间差异不显著（P＞0.05），但二者分别与20min运动训练组和80min运动训练组之间有显著性差异（P＜0.05）（表1）。

表1 运动对大鼠血清中SOD浓度的影响Table 1 Effect of exercise on SOD concentration in the serum of rats

2.2 SOD在不同运动组大鼠卵巢中的表达结果

在对照组大鼠卵巢黄体的颗粒性黄体细胞中SOD免疫反应阳性产物为蓝色强阳性表达，阳性胞体内深蓝色的阳性表达产物融合为团状，阳性颗粒染成一片，阳性细胞体间的轮廓清晰，阳性细胞中阳性产物定位在胞膜和部分胞质，胞核不着色呈现空泡状（图1A）。40min和60min运动组大鼠的颗粒性黄体细胞中SOD免疫反应阳性产物呈现蓝黑色的强阳性表达，阳性细胞多为聚集或分散存在，阳性细胞呈不规则的圆形、卵圆形以及梭形等（图1C和图1D）。在20min和80min运动组大鼠的卵巢粒性黄体细胞中SOD免疫反应阳性产物均呈蓝色的弱阳性表达，阳性表达的细胞体轮廓模糊不清，用高倍镜才可以看到阳性细胞中含有少量的浅蓝色阳性颗粒。阳性表达的细胞体多为不规则的圆形和卵圆形（图1B和图1E，表2）。

表2 SOD在不同实验组大鼠卵巢中的表达Table 2 The expression of SOD in the ovary of exprimental rats

图1 SOD在不同运动组大鼠卵巢中的表达Fig.1 The expression of SOD in the ovaries of different groups of rats

3 讨论

SOD作为生物体内的重要抗氧化酶，可清除细胞代谢过程中所产生的氧自由基，并可以降低氧自由基对细胞造成的损害，从而与机体的衰老机制的调控密切相关［9－10］。运动本身可以对机体造成一种刺激，这种刺激会导致机体的功能和内环境发生不同程度的应激，运动时间长短不同，对应激反应的强弱也有一定的差异。本试验结果表明，大鼠短时间运动20min后，其血液中SOD的浓度与0min运动组相比略有增高而差异不显着，说明，短时间运动不能达到机体的应激反应阈值，对机体衰老也不会产生影响。但是随着大鼠运动时间开始增加，每日的运动时间增加到40min，甚至增加到60min，大鼠血清中SOD浓度与对照组相比含量增高而有显著性差异（P＜0.05）这一研究结果提示，适当的运动可以促使有机体产生一些有利的应激反应，使细胞内产生大量的SOD，提高了细胞对氧自由基的清除作用，从而对机体起到了抗衰老的作用［11］。当大鼠每日运动时长增加到80min，血液中SOD浓度与0min运动组相比却没有随着运动时间的延长而浓度增高，而是出现了明显的降低（P＜0.05），提示，长时间运动会使机体应激过度而处于比较疲惫状态，使得机体失去代偿状态的大量细胞不能产生相应浓度的SOD，并导致细胞内大量氧化物堆积而不能及时清除，不但不能对衰老起到延缓作用，还会对机体产生一定程度的损伤作用。

运动本身是一种强烈的刺激性活动，会造成机体的耗氧和耗能增加，而产生一定的自由基。SOD在清除氧自由基过程中会大量消耗，有机体则可以通过正反馈调节机制增强细胞SOD的表达。在本研究中，20min运动组卵巢黄体中SOD的表达与对照组之间无显着性的差异（P＞0.05）。提示，随着大鼠运动时间的增加，机体相应的会提高SOD的表达以应对其不断的消耗，但由于运动时间较短，体内产生的氧自由基数量较少，短时间不能达到反馈调节阈值，因此，SOD的水平没有增加。随着运动时间的进一步增加，当增加到40min和60min时，细胞在耗氧和耗能过程中会产生大量氧自由基，细胞内储存的SOD会消耗殆尽。为平衡机体代谢，细胞会做出相应的调节［12］，以提高SOD的表达，增加细胞SOD的含量，减少氧自由基的损伤［13－14］。但是，随着运动时间的进一步增加，当运动时间增加到80min时，运动训练组大鼠较对照组卵巢黄体中SOD水平有所降低而差异显着（P＜0.05）。长时间运动会导致细胞内SOD水平消耗过多，或者是由于清除氧自由基会消耗大量SOD，使其在体内的含量降低。

综上所述，当机体受到运动刺激时，细胞内会迅速产生大量氧自由基，消耗了细胞内储存的SOD。随着运动时间的延长，细胞耗氧耗能增加，最终导致胞内储存的SOD消耗殆尽，细胞开始出现一系列适应性反应，以增加细胞内SOD的水平，减少氧自由基对机体的损伤，随着运动时间的进一步延长，有机体开始处于过度疲惫状态，机体内失去代偿状态的大量细胞不能产生足够的SOD，使机体内SOD水平下降，最终导致细胞内的过氧化物堆积和细胞损伤。

［1］Itoh M，Oh－ishi S，Hatao H，et al.Effects of dietary calcium restriction and acute exercise on the antioxidant enzyme system and oxidative stress in rat diaphragm［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2004，287：33－38.

［2］Mitsuoka H，Unnon N，Sakurai T.Pathophysiological role of endothelins in pulmonary microcirculatory disorders due to intestinal ischemia and reperfusion［J］.J Surg Res，1999，87（2）：143－151.

［3］卞龙艳，蒋 丹，林 芳.运动对成年小鼠肌肉氧自由基和自噬水平的影响［J］.苏州大学学报：医学版，2012，32（4）：510－513.

［4］Ye N，Liu S，Lin Y，et al.Protective effects of intraperitoneal injection of TAT－SOD against focal cerebral ischemia／reperfusion injury in rats［J］.Life Sci，2011，89（23／24）：868－874.

［5］公铁红，付淑华，牛嗣云，等.衰老大鼠睾丸组织SOD、MDA和血清睾酮含量的变化［J］.承德医学院学报，2012，29（1）：14－16.

［6］蔡崇岳，章振保，田生平.衰老雄性大鼠睾丸组织抗氧化酶与血清睾丸酮水平、凋亡蛋白酶－3基因表达的研究［J］.汕头大学医学院学报，2006，19（3）：154－157.

［7］李芳晖，杨海平，王景贵，等.去乙酰化酶1介导衰老相关疾病的发病机制及其与运动的关系［J］.中国运动医学杂志，2012，31（11）：1014－1020.

［8］胡昌东，归绥琪.自然流产患者滋养细胞肝素表皮生长因子的表达和意义［J］.上海医学，2004，27（7）：491－494.

［9］项红军，赵佐庆，李纪鹏，等.大鼠小肠缺血再灌注后血中NO，SOD浓度及肺中Bax，Bcl－2表达的改变［J］.第四军医大学学报，2002，23（21）：1974－1977.

［10］Flint A C，Kame H，Navi B B，et al.Statin use during ischemic stroke hospitalization is strongly associated with improved poststroke surviva［J］.Stroke，2012，43（1）：147－154.

［11］Hollander J，Fiebig R，Ookawara T，et al.et al.Superoxide dismutase gene expression is activated by a single bout of exercise in rat skeletal muscle［J］.Eur J Physiol，2001，442（3）：426－434.

［12］Ji L L，Dillon D，Wu E.Alteration of antioxidant enzymes with aging in rat skeletal muscle and liver［J］.Am J Physiol，1990，258（4）：918－923.

［13］Hatao H，Oh－ishi S，Itoh M，et al.Effects of acute exercise on lung antioxidant enzymes in young and old rats［J］.Mech Ageing Dev，2006，127（4）：384－390.

［14］AmeLIE Rebillard，Luz Lefeuvre－Offila，Jordan Gueritat，et al.Prostate cancer physical：Adaptive response to oxidative stress［J］.Free Radical Biol Med，2013，60：115－124.