维药菊苣提取物对Balb/c小鼠肝纤维化的治疗作用研究

向莉琳，李 巍，武 欣，王新春，简炎林*

(1.深圳市第三人民医院药剂科，广东 深圳 518112；2.石河子大学第一附属医院，新疆 石河子 832000)

维药菊苣提取物对Balb/c小鼠肝纤维化的治疗作用研究

向莉琳1，李 巍1，武 欣1，王新春2，简炎林1*

(1.深圳市第三人民医院药剂科，广东 深圳 518112；2.石河子大学第一附属医院，新疆 石河子 832000)

目的 探讨维药菊苣正丁醇提取物（CGB）抗雄性小鼠肝纤维化的治疗作用。方法 采用刀豆凝集素（Con A）在Balb/c雄性小鼠诱导肝纤维化，造模成功后第6周分别用低剂量 （100 mg/kg）和高剂量 （500 mg/kg）CGB干预治疗，并以秋水仙碱（0.1 mg/kg）做阳性对照。治疗第10周处死小鼠留取肝脏组织和血清，比较各组小鼠肝功能、关键性肝纤维化指标。病理分析肝脏组织变化和TGF-β1/Smad信号通路相关因子表达差异。结果 与模型组比较，CGB治疗组的肝功能指标（ALT，AST）和血清肝纤四项指标（PC-Ⅲ、CIV、LN和HA）指标不同程度降低（P＜0.05）；肝组织TGF-β1蛋白表达下降，Smad7蛋白表达升高（P＜0.05）。肝脏组织病理显示，不同剂量CGB治疗均能一定程度上减缓小鼠肝纤维化的发展。结论 CGB具有抗肝纤维化的活性，影响TGF-β1/ Smad信号通路可能是其潜在的抗肝纤维化作用机制。

菊苣；肝纤维化；刀豆凝集素；TGF-β1蛋白；Smad7蛋白

肝纤维化作为多种慢性肝脏疾病晚期恶化至肝硬化的中心环节，是继发于肝脏炎症或组织修复过程中细胞外基质蛋白 （extracellular matrixc，ECM）合成增多和成分改变导致的过度沉积而形成的病理性改变。随着对肝纤维化发生机制研究的不断深入，研究证明转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)通过促进肝成纤维细胞的增殖，激活成纤维细胞的聚集，调控胶原蛋白、蛋白多糖等ECM的合成和代谢，在肝纤维化发展过程起关键作用[1]。维药菊苣又名蓝菊，源自菊科菊苣属的一年生草本植物毛菊苣 (Cichorium glandulosum Boiss)，广泛分布于欧亚等地区。其根茎及种子系我国西北少数民族常用药材，具开通阻滞、利尿、消肿、清热的作用[2]。近年来随着天然产物分离技术的快速发展，菊苣根及种子的提取物在抗肿瘤、抗炎性反应和保肝等作用获得广泛关注[3-5]。实验研究表明维药菊苣全草的脂溶性提取物(CGB)富含三萜类、黄酮类化合物，水溶性提取物(CGW)富含糖类，均能起到抗肝纤维化的作用，但药理药效的作用机制存在明显差异，有待进一步研究[6]。

本实验旨在通过建立刀豆凝集素Con A诱导所致的Balb/c雄性小鼠肝纤维化模型，并以CGB为研究对象，观察其对阻断小鼠纤维化的的作用及对肝TGF-β1和Smad7蛋白表达的影响，探讨潜在的抗纤维化作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级Balb/c雄性小鼠60只，8周龄，体质量(20±2)g，购于深圳市第三人民医院动物实验公共服务平台,许可证号:SYXK（粤）2012-0120。小鼠在实验过程中均自由摄食，动物饲养房保持恒定温度24℃，光照时间按照日照时间随昼夜变化。

1.2 药物与试剂

CGB(主成分为倍半萜内酯类和黄酮类成分，由新疆石河子大学药学院馈赠)，秋水仙碱片(西双版纳药业有限公司)，Con A(25 mg/支，美国Sigma公司)。PC III、CIV、LN和HA ELISA试剂盒[基尔顿生物科技（上海）有限公司]，ALT和AST测试盒(南京建成生物工程研究所)，TGF-β1和Smad7抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.3 主要仪器

STP-120脱水机(德国Microm)；KD-BM包埋机(浙江科迪)；HM355S型全自动石蜡切片机 （美国Thermo Scientific）；Cryotome FE切片机 (英国Sandon)；BH2显微镜 （日本Olympus）；Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo Scientific)。

2 方法

2.1 造模与分组

60只小鼠中随机取出10只作为正常组。剩余小鼠按经尾静脉注射 Con A 15 mg/kg造模[7]，每周1次，连续6周。第6周后将剩余存活的40只小鼠应用随机数字表分组法分为4组，每组10只。阳性对照组给予秋水仙碱0.1 mg/kg，CGB高、低剂量组的给药量分别为100、500 mg/kg[4]。灌胃体积均为0.5 mL/10 g，正常组和模型组均经口灌胃给予相应体积的蒸馏水。每日1次，连续4周。给药期间继续造模至第10周末。

2.2 观察指标

2.2.1 一般情况观察 观察小鼠一般状况如饮食变化、行为、皮肤黏膜颜色改变和体质量等。

2.2.2 生化指标的检测[8]各组小鼠均于第10周末处死，采用眼眶法取血，静置2 h后3 500 r/min离心10 min，分离血清，血清作生化及肝纤维化指标的测定用，-20℃冰箱保存。多功能酶标仪检测肝功能 ALT和 AST指标，ELISA法检测肝纤维化HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ指标。

2.2.3 肝脏病理组织学观察 小鼠肝脏取出后用PBS冲洗去杂质，在肝左叶最大截面处取组织置于4%多聚甲醛液固定24 h，常规石蜡包埋，做好标记，苏木素-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察肝脏病理组织学改变，并按照中华肝脏病学会提出的肝纤维化分级标准对肝脏切片进行纤维化程度评估[9]。具体为:0:无肝纤维化；Ⅰ:轻度胶原纤维增生；Ⅱ:胶原纤维明显增多，在汇管区以及中央静脉部位有明显增加的胶原纤维，大致呈星形向外侧发散延伸，但是并没有纤维间隔形成；Ⅲ:小叶内偶见纤维胶原间断，纤维增加严重，纤维间隔形成，但是互相之间没有形成连接的纤维隔断；Ⅳ:肝脏中有大部分形成彼此相连的纤维间隔，分割肝实质伴随肝小叶结构的紊乱。

2.2.4 TGF-β1/Smad信号通路相关因子检测 免疫组化染色法检测TGF-β1、Smad7蛋白表达水平。肝左叶切片30 mL/L过氧化氢甲醇溶液灭活内源性过氧化氢酶，室温封闭后分别滴加兔抗小鼠TGFβ1抗体（1∶500）、单克隆 Smad7抗体（1∶100），4℃过夜，PBS洗涤后DAB显色，在Olympus BH2显微镜下采集图像，以运用IPP 6.0软件对图片作半定量分析，测定平均光密度值。

2.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 20.0软件进行分析，计量资料用“±s”表示，不同治疗组与模型组之间比较采用One-way ANOVA（单因素方差分析）和独立t检验进行统计分析，以P＜0.05为差异具有显著性。

3 结果

3.1 CGB对小鼠一般情况的影响

完成实验后，正常组小鼠生长状态良好，体质量有明显增长，反应灵敏，皮毛有光泽。模型组小鼠与正常组小鼠相比，生理机能明显被破坏，存在毛色灰暗，无光泽，反应迟钝等现象。治疗组小鼠经CGB各剂量治疗后，小鼠食欲正常，活动状态明显改善，体质量增长速度明显高于模型组，与正常组基本一致。从体质量外观变化与活动能力说明各CGB治疗组存在明确的治疗作用。

3.2 CGB对肝纤维化小鼠肝脏病理学改变的影响

按肝纤维化分级标准对各个组肝纤维化进行了评分、比较，如表1。HE染色结果显示模型组Con A造成肝纤维大量增生，肝小叶结构破坏，肝脏功能受损，纤维化程度分级为为Ⅲ和Ⅳ。各治疗组与模型组比较，部分消除肝纤维的增生后，肝窦明显，肝细胞胞质均匀，水肿明显减轻。

表1 CGB对Con A致肝纤维化小鼠肝组织病理学影响 (n=10)

图1 CGB对Con A致肝纤维化小鼠肝组织病理学改变光镜图（HE，×100）

3.3 CGB对小鼠血清中ALT，AST的影响

与正常组比较，模型组小鼠血清中ALT，AST活性显著升高(P＜0.01)，提示造模成功。与模型组比较，CGB高、低剂量组和秋水仙碱组小鼠血清中ALT、AST活性显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，提示药物有预防肝纤维化作用，其中，500 mg/kg CGB治疗组效果最好、活性最高。结果见表2。

3.4 CGB小鼠肝纤化四项的影响

表2 CGB对Con A致肝纤维化小鼠血清ALT和AST的影响 (n=10，±s)

表2 CGB对Con A致肝纤维化小鼠血清ALT和AST的影响 (n=10，±s)

注:与正常组比较##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。下表同。

组别正常组模型组秋水仙碱组CGB低组CGB高组剂量(mg/kg) --0.1 100 500 ALT（IU/L）47.01±14.11 142.7±34.51##96.53±17.39*102.5±15.28*78.31±9.76**AST（IU/L）192.8±17.77 368.2±61.56##288.4±46.35*276.4±31.76*222.4±24.38**

模型组与正常组小鼠血清中HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ的含量相比存在显著性差异(P＜0.01)，提示造模成功。造模8周后，CGB高、低剂量组和秋水仙碱组的HA，LN，PC-Ⅲ和C-Ⅳ的含量均低于模型组，存在显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)，其中CGB高剂量组与模型组间存在非常显著性差异(P＜0.01)，结果见表3。

表3 CGB对Con A致肝纤维化小鼠血清HA，LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ的影响 (n=10，±s)

表3 CGB对Con A致肝纤维化小鼠血清HA，LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ的影响 (n=10，±s)

组别 剂量(mg/kg)正常模型秋水仙碱CGB低CGB高--0.1 100 500 HA (ng/mL) 129.5±11.1 302.8±43.0##245.5±57.0*224.6±29.4*147.5±47.3**LN (ng/mL) 532.3±48.0 729.5±86.6##642.8±44.8*669.2±31.3*602.3±75.4*PC-Ⅲ(μg/mL) 17.83±4.79 66.42±14.88##24.51±6.63*18.42±2.55*16.72±1.93**C-Ⅳ(ng/mL) 8.53±1.44 23.81±5.11##16.17±2.45*15.31±2.74*12.45±1.68**

3.5 CGB对小鼠肝组织中TGF-β1、Smad7蛋白表达水平的影响

与正常组比较，模型组TGF-β1吸光度明显增强(P＜0.01)；高低剂量的CGB治疗组和秋水仙碱组作用4周后，TGFβ1蛋白表达均较模型组降低 (P＜0.05或P＜0.01)，高剂量组减少较为明显。Smad7的蛋白表达，正常组的明显高于模型组(P＜0.01)；高低剂量的CGB治疗组和秋水仙碱组均较模型组升高(P＜0.05或P＜0.01)，高剂量组增加较为明显。结果见表4。

表4 CGB对Con A致肝纤维化小鼠肝组织中TGF-β1、Smad7蛋白表达水平的影响 (n=10，±s)

表4 CGB对Con A致肝纤维化小鼠肝组织中TGF-β1、Smad7蛋白表达水平的影响 (n=10，±s)

组别正常模型秋水仙碱CGB低CGB高剂量(mg/kg) --0.1 100 500 TGF-β10.121±0.016 0.181±0.037##0.163±0.017*0.149±0.024*0.126±0.019**Smad7 0.118±0.011 0.058±0.004##0.082±0.003*0.077±0.005*0.106±0.013**

4 讨论

目前针对维药菊苣保肝作用的研究较多，但主要集中于对CCl4诱导的大鼠肝纤维化和急性酒精肝损伤治疗作用。与CCl4诱导的化学性肝损伤模型不同，Con A诱导的免疫性肝损伤模型涉及T细胞、巨噬细胞的活化，细胞因子的释放等多种因素，其发病机制与乙肝致肝纤维化的机制更接近[10]。本研究中，CGB应用于Con A诱导的小鼠肝纤维化模型，其预防和治疗作用也是通过检验乙肝常用肝功能和肝纤维化指标观察。ALT和AST是常用的肝功能指标，正常情况下两者均储存于肝细胞膜和线粒体中，当肝脏部位存在炎性反应时，ALT和AST就会释放到血液中，导致指标升高。所以转氨酶数值居高不降反映出肝脏组织存在持续的炎症反应，导致细胞肿胀坏死，而转氨酶的下降说明疾病状态的恢复。与模型组相比，CGB各剂量组均能够抑制血清中 ALT、AST的升高，说明CGB能明显改善肝组织损伤情况。另外，肝纤维化的程度可通过检测常用的肝纤维化相关标志物进行判断，目前组织和血清中的HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ含量与肝纤维化的发展程度有密切关系[11]。本研究结果发现，与模型组相比，各剂量的CGB治疗组均能抑制血清HA、LN、PC-Ⅲ和C-Ⅳ水平，说明维药菊苣正丁醇提取物CGB能延缓肝纤维化的进展。

TGF-β1是一族具有多种生物活性的碱性蛋白质，至少有5个亚型，其中TGF-β1活性最强，被认为是肝纤维化快速发展的关键因素之一[12]。TGF-β1在肝纤维化早期分泌增多，通过与受体结合，大量激活下游信号分子Smad家族蛋白。Smad形成同源/异源寡聚体进入细胞核后，调节靶基因的转录，对成纤维细胞和巨噬细胞产生趋化作用，诱导这些细胞过度分泌促炎物质和纤维化细胞因子，使ECM过度沉积，导致肝纤维化的发展。在TGF-β1/Smad信号通路中，Smad家族的不同亚型起到差异化的调控作用，Smad2/3磷酸化激活转入细胞核后，在细胞水平上介导TGF-β1发挥其生物学效应；而Smad6/7却可以抑制TGF-β1复合体磷酸化Smad2/3这一过程，对TGF-β1的生物学效应起到平衡调节作用[13]。在本实验中，通过Con A制备小鼠肝纤维化模型后给予CGB灌胃干预后，测得TGF-β1和Smad7表达水平均与正常组接近，明显区别于模型组 （P＜0.05或P＜0.01），说明CGB抗肝纤维化的作用与TGF-β1/Smad信号通路相关。而治疗组和模型组比较，TGF-β1表达下降，Smad7表达升高，进一步明确CGB对TGF-β1/Smad信号通路的调控作用是通过促进Smad7分泌,抑制TGF-β1表达实现的。

本研究表明CGB能有效预防和治疗Con A诱导的小鼠肝纤维化,调控肝细胞TGF-β1/Smad信号通路，阻断TGF-β1蛋白合成，缓解肝纤维化发展可能是CGB抗纤维化的分子机制之一。

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（本文编辑 杨 瑛）

Therapeutic Effects of Uigur Medicine Cichorium glandulosum Boiss Extracts on Hepatic Fibrosis in Balb/c Mice

Li-Lin Xiang1,Wei Li1,Xin Wu1,Xin-Chun Wang2,Yan-Lin Jian1*
(1.Department of Pharmacy,The Third People Hospital of Shenzhen,Shenzhen,Guangdong 518112,China; 2.The First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832000,China)

Objective To investigate the therapeutic effects of the N-butyl alcohol extracts of Cichorium glandulosum Boiss(CGB)on hepatic fibrosis in mice.Methods A standard model of concanavalin A(Con A)induced Balb/c mice heptic fibrosis was established,and the treated groups were given 100 mg/kg and 500 mg/kg CGB,respectively.Colchicine (0.1 mg/ kg)was used as positive control group.At 10th week of treatment,all mice were scarified to take liver tissue and serum.The serum liver function index and liver fibrosis index levels in all groups were compared.The changes of liver tissue and expressions of TGF-β1/Smad were made pathologic analyses.Results In Con A induced Balb/c mice,CGB resisted,suppressed Compared with the model group,the liver function index (ALT,AST)and indexes of hepatic fibrosis (PC-III,CIV,LN and HA)in CGB treatment group were reduced in different degrees(P＜0.05);The expression of TGF-β1was decreased and expression of Smad7 was increased(P＜0.05).Pathological results indicated different doses can improve the hepatic fibrosis of Balb/c mice.Conclusion CGB show the anti-hepatic fibrosis effect,its potential mechanism maybe related with the regulation of TGF-β1/Smad signal channel.

Cichorium glandulosum boiss;liver fibrosis;concanavalin A;TGF-β1;Smad7

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.08.008

2015-06-03

深圳市科技计划项目（201203067）；深圳市新发传染病重点专科基金资助项目(201161)。

向莉琳，女，副主任药师，研究方向:医院药学。

筒炎林，男，主任药师，Email:james766＠139.com。