姜黄素衍生物B06对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用*

曾聪聪, 刘 曦， 刘网网， 王 玲， 程锦国, 陈三妹, 陈国荣△

(1. 温州医科大学附属第二医院， 浙江 温州 325000； 2. 温州医科大学附属第一医院病理科， 浙江 温州 325015； 3. 绍兴文理学院医学院, 浙江 绍兴 312000)



姜黄素衍生物B06对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用*

曾聪聪1, 刘 曦1， 刘网网2， 王 玲2， 程锦国1, 陈三妹3△, 陈国荣2△

(1. 温州医科大学附属第二医院， 浙江 温州 325000； 2. 温州医科大学附属第一医院病理科， 浙江 温州 325015； 3. 绍兴文理学院医学院, 浙江 绍兴 312000)

目的：观察姜黄素衍生物B06对2型糖尿病大鼠肾脏的保护作用及机制。方法：雄性SD大鼠35只，随机均分成5组(n=7)：正常对照组、高脂组、高脂治疗组、糖尿病组、糖尿病治疗组。采用高脂饮食结合链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠模型。治疗组给予0.2 mg/kg·d剂量的B06灌胃，维持8周。检测血肌酐、尿素氮、尿酸，光镜和电镜观察大鼠肾组织的形态学改变，Masson染色观察肾组织的胶原纤维，并用免疫组化方法检测肾脏IV型胶原、纤维连接蛋白的表达。结果：糖尿病组大鼠血肌酐、尿素氮水平升高；光镜下见肾小球系膜基质增多，胶原纤维增多，肾小球毛细血管基底膜增厚；电镜下足细胞足突肿胀及足突融合；Masson染色示肾小球亮绿色阳性基质增多；免疫组化显示IV型胶原、纤维连接蛋白的表达水平升高。经B06干预后，血肌酐、尿素氮下降；肾小球病变减轻，肾脏组织IV型胶原、纤维连接蛋白的表达水平降低。结论：B06对2型糖尿病大鼠的肾脏具有保护作用，其机制可能是通过降低肾脏IV型胶原、纤维连接蛋白的表达，从而抑制细胞外基质的积聚和肾小球系膜增殖,发挥抗肾纤维化的作用。

糖尿病；高脂；姜黄素衍生物B06；IV型胶原；纤维连接蛋白；肾脏；大鼠

随着2型糖尿病发病率的上升，作为糖尿病最常见、最严重的并发症之一，糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)的发病率也逐年上升。但是，由于该病发病机制尚不明确，现代医学主要采用降糖、降压等对症治疗，尚未发现理想的药物能逆转或阻断 DN 的发展。祖国医学中虽无“糖尿病肾病”独立病名的记载，但其与“肾水”、“消渴”密切相关。中医认为糖尿病肾病的病机可概括为“本虚标实”，以阳虚为本，痰、湿、瘀为邪实，其中血瘀贯穿疾病始终，故活血化瘀通络是基本治疗原则，临床上可选用活血药为主。姜黄素是从中药姜黄的根茎中提取出来的酚类色素[1]，具有抗炎、抗氧化、消除氧自由基、抗肿瘤、降血脂等多种药理作用。而B06是姜黄素类似物的一种，它不仅具有姜黄素的一般特性，而且由于它去除了不稳定的β-二酮基团，使得其在代谢、生物利用度等方面均优于姜黄素，从而更好地发挥姜黄素的药理作用。本研究室前期的实验证实了B06对糖尿病大鼠的心肌[2]、肝脏[3]均有保护作用，然而B06对糖尿病大鼠的肾脏病变是否有作用目前还未见报道。本研究通过对高脂组、糖尿病组大鼠行BO6干预，观察大鼠肾功能相关指标的变化及肾脏的形态学表现，并检测肾组织的IV型胶原(collagen IV，Col-IV)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)的表达水平，研究B06对糖尿病大鼠肾脏病变的影响及其机制，为糖尿病肾病的治疗提供新的思路和依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型建立

健康SPF级雄性SD大鼠35只(温州医科大学实验动物中心提供)，体重(180±20)g，普通饲料适应性喂养一周后，随机均分成5组(n=7)：正常对照(normal control，NC)组、高脂(high-fat，HF)组、高脂治疗(HF+B06 treatment，FT)组、糖尿病(diabetes mellitus, DM)组、糖尿病治疗(DM+B06 treatment, DT)组[2]。对照组继续普通饲料喂养，其余组改用高脂饲料(饲料配方参考文献[4])喂养4周，诱发胰岛素抵抗。采用腹腔注射30 mg/kg 剂量链脲佐菌素的方法制造2型糖尿病大鼠模型，72 h后尾静脉测血糖,血糖>16. 7 mmol/L为造模成功。造模完成后，FT、DT组按0.2 mg/kg·d剂量的B06(溶于2%羧甲基纤维素钠)灌胃8周。以往研究证明2%羧甲基纤维素钠对本实验结果无影响，故不再设单纯生理盐水灌胃组。因此NC组、HF组、DM组给予等容积的2%羧甲基纤维素钠灌胃。实验期间动物自由进食进水，未使用胰岛素及其它降糖药物。治疗结束，禁食12 h，股动脉放血处死动物。

1.2 药品与试剂

姜黄素衍生物B06(纯度为99.2%)，由温州医科大学药学院梁广教授惠赠；链脲佐菌素、胰岛素检测试剂盒分别购于购于厦门星隆达化学试剂、上海西塘生物科技有限公司；Anti-FN、Anti-Col-IV、兔二抗购于北京中杉金桥生物试剂公司。

1.3 生化指标的检测

1.3.1 空腹血糖(fasting blood-glucose，FBG)、血胰岛素(fast insulin，FINs)、血胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)、总甘油三酯(total triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)的测定

1.3.2 血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、尿酸(uric acid,UA)的测定 实验结束后分别取上述5组大鼠，股动脉放血处死，取血,室温凝固约30 min，3 000 r/min离心10 min，取上清液，用日立7600大型生化分析仪检测各组大鼠FBG、TG和TC、Scr、BUN、UA。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定FINs，并计算HOMA-IR。

1.4 光镜标本制备

1.4.1 HE染色标本制备 大鼠肾脏皮质处取3 mm厚度的小块组织，置于10%中性福尔马林固定液中固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋之后，制成厚度3 μm的切片，行HE染色，中性树胶封固。光镜下观察肾小球体积大小、系膜基质、毛细血管基底膜等的变化情况。

1.4.2 胶原纤维(Masson)染色标本制备 石蜡切片，常规脱蜡，苏木素染色5 min，1%盐酸酒精分化2 s，冲水17 min，置Masson液(组成成份：变色酸2R 0.25 g、磷钨酸0.5 g、冰醋酸0.5 ml、蒸馏水50 ml)中染色5 min，水洗，亮绿液染色5 min，95%乙醇脱水1 min，于石碳酸二甲苯中3 s，二甲苯透明，中性树胶封固。光镜下观察肾脏胶原纤维的染色情况。

1.5 电镜标本制备

取肾脏皮质处大小约1 mm×1 mm×1 mm的组织一块，置于2.5%的戊二醛溶液中，于4℃固定l h，PBS漂洗，锇酸后固定，PBS漂洗之后，丙酮梯度脱水。Epon8l2包埋，半薄切片进行定位之后，用RMC—XL型超薄切片机切片，采用铅铀双重染色，在H-7500型透射电镜下进行观察。

1.6 免疫组织化学染色法检测肾脏组织中Col-IV、FN蛋白的表达水平

肾脏组织经固定，常规脱水包埋。石蜡切片至3 μm厚度，经烘烤、二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水、3%过氧化氢孵育、高压抗原修复、山羊血清封闭后，滴加Ⅰ抗抗体，4℃冰箱过夜，然后滴加Ⅱ抗，37℃孵育30 min，DAB显色1～3 min，苏木素复染，透明、固封。PBS代替一抗作阴性对照。选取肾小球毛细血管基底膜或者系膜基质对Col-IV、FN进行定位。对其定量分析采用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件进行。并对所得数据采用统计学分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠血生化指标检测结果

2.1.1 FBG、FINs、HOMA-IR、及TG、TC检测结果 与NC组相比较，HF组FBG、HOMA-IR及TG明显升高(P<0.01)，FINs、TC升高(P<0.05)； DM组FBG、HOMA-IR和TG、TC明显升高(P<0.01)，FINs差异不显著，但有升高趋势；DM组较HF组FBG、HOMA-IR、TG、TC水平明显上升(P<0.01)，分析DM组糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗更明显。经B06干预后，FT组、DT组大鼠的血糖血脂大多指标均明显降低(P<0.01，表1)。

2.1.2 Scr、BUN、UA结果 与NC组相比，HF组血清Scr、BUN水平有升高趋势，但差异不显著；DM组Scr、BUN较NC组明显升高(P<0.01),与HF组相比，虽无统计学意义，但可见明显的上升趋势；经B06干预后，FT组 Scr、BUN水平均有所下降，但差异不显著，而DT组较DM组Scr、BUN下降，有显著性差异(P<0.01)。两治疗组之间Scr、BUN差异不显著。分析姜黄素B06对糖尿病肾病的肾功能具有一定的保护作用。各组之间UA水平无显著性差异(表2)。

Tab. 1 Comparision of levels of FBG,FINs,HOMA-IR and TG,TC among various groups(n=7，±s)

NC： Normal control； HF： High fat； FT： High fat treatment； DM： Diabetes mellitus； DT： Diabetes treatment； FBG： Fasting blood glucose； FINs： Fasting insulin； HOMA-IR： Homeostasis model assessment of insulin resistance； TG： Triglyceride； TC： Total cholesterol

*P<0.05,**P<0.01vsNC;##P<0.01vsHF;ΔΔP<0.01vsDM

GroupScr(μmol/L)BUN(mmol/L)UA(mmol/L)NC31.01±8.427.16±1.09103.14±32.61HF39.76±8.218.95±1.06104.70±33.51DM70.34±17.28**14.68±2.34**109.43±30.19FT32.10±8.167.99±1.76122.00±25.12DT33.00±8.12##9.22±1.92##102.43±28.60

NC: Normal control; HF: High fat; FT: High fat treatment; DM: Diabetes mellitus; DT: Diabetes treatment; Scr: Serum creatinine; BUN: Blood urea nitrogen ; UA: Uric acid

**P<0.01vsNC；##P<0.01vsDM

2 肾脏的形态学改变

2.1 光镜下观察结果

(1)HE染色：NC组大鼠肾小球毛细血管管腔规则，管壁菲薄，肾小球体积未见肥大，结构完整(图1A)。与NC组相比，DM组及HF组大鼠的肾小球体积增大，毛细血管袢卷曲紊乱，系膜区增大，系膜基质增生。其中DM组(图1B)病变较HF组(图1C)更明显。经B06干预后，FT组(图1D)、DT组(图1E)肾组织病变有所减轻(图1，见彩图页Ⅳ)。(2)Masson染色：NC组大鼠肾小球毛细血管基底膜显示少量呈亮绿色的胶原纤维(图2A)。与NC组相比，DM组(图2B)和HF组(图2C)大鼠肾脏表现为系膜基质增多，主要位于肾小球系膜区，并可见亮绿色的胶原纤维增多，提示毛细血管基底膜增厚。B06干预后，FT组(图2D)、DT组(图2E)亮绿色阳性基质稀疏减少，毛细血管基底膜结构改善(图2，见彩图页Ⅳ)。

2.2 电镜超微结构观察结果

电镜下可以观察到，肾小球滤过膜由毛细血管内皮细胞、基底膜、足细胞突起构成，NC组大鼠肾小球滤过膜的基底膜厚度均匀一致，足突细长(图3A)。与NC组相比，DM组(图3B)、HF组(图3C)大鼠的基底膜轻度增厚，足突肿胀、变短、融合，线粒体肿胀。B06干预后，FT组(图3D)、DT组(图3E)大鼠肾小球毛细血管基底膜基本恢复正常，足突肿胀减轻，足突融合现象减少，分析可能因为姜黄素B06能保护足细胞的结构完整。

Fig. 3 Kidney tissue morphological changes of each group(TEM×10 000)

A: Normal control group； B: Diabetes mellitus group； C: High fat group； D: Diabetes treatmen group； E: High fat treatment group

2.3 肾脏组织Col-IV、FN蛋白免疫组织化学结果

2.3.1 Col-IV在各组大鼠肾脏的表达情况 NC组大鼠的肾组织中有少量的Col-IV表达，在肾小球系膜区、毛细血管基底膜及肾球囊基底膜可见微量的棕黄色染色，呈弱阳性(图4A)。DM组(图4B)、HF组(图4C)肾组织中Col-IV表达明显增强(P<0.01)，肾小球系膜区、毛细血管基底膜及肾球囊基底膜染色明显加深，出现棕黄色深染的粗线条，呈强阳性。经B06干预后，FT组肾组织Col-IV蛋白表达水平有降低趋势(图4D)；DT组(图4E，图4见彩图页Ⅳ)肾组织Col-IV表达水平明显减弱(P<0.05，表3)。表明姜黄素B06能明显减少肾脏组织Col-IV的异常沉积。

GroupCol-IV(IOD×105)FN(IOD×105)NC0.34±0.030.31±0.04HF0.40±0.02**0.36±0.02**FT0.37±0.030.32±0.03##DM0.50±0.09**0.43±0.06**DT0.36±0.09Δ0.35±0.072ΔΔ

NC: Normal control; HF: High fat; FT: High fat treatment; DM: Diabetes mellitus; DT: Diabetes treatment; Col-IV: Collogen IV; FN: Fibronectin

**P<0.01vsNC；##P<0.01vsHF；ΔP<0.05,ΔΔP<0.01vsDM

2.3.2 FN在各组大鼠肾脏的表达情况 NC组大鼠肾小球FN蛋白呈弱阳性表达，可见呈网状或细线条状分布的棕黄色颗粒(图5A)，DM组(图5B)、HF组(图5C)大鼠肾小球内FN呈强阳性表达(P<0.01)，在图中可见肾小球毛细血管基底膜染色显著加深。经B06干预后，FT组(图5D)、DT组(图5E，图5见彩图页Ⅳ)FN表达较之前明显减低(P<0.01，表3)。分析可能因为姜黄素B06能减少FN在肾小球基底膜的沉积，从而保护肾脏结构。

3 讨论

DN作为最严重的糖尿病微血管病变之一, 是引起终末期肾功能衰竭的主要原因[5]。进展到后期，由于严重的代谢紊乱，在治疗上通常比其他肾病更加困难。祖国医药以其多途径、多靶点、副作用少的特点,而有着极大的优势和潜力。药理学研究现较为明确的有效的中药活性成分主要有：生物碱、蒽醌类、多糖[6]、皂苷、黄酮、萜类等[7]。主要作用机理[8]是：促进胰岛素分泌,增加组织对外周葡萄糖的摄取利用、促进葡萄糖转运,改善糖脂代谢和胰岛素的敏感性等,以此达到降糖及改善胰岛素抵抗的作用；另外还对糖尿病的并发症具有一定的防治作用。

现代研究认为，胰岛素抵抗与胰岛素分泌缺陷是2型糖尿病的发病基础，而高脂血症可抑制胰岛素的输送与外周葡萄糖的利用，因此高脂血症被认为是促进2型糖尿病发生发展的危险因素之一。高脂血症的脂代谢紊乱表现为高甘油三酯、低密度脂蛋白增高、高密度脂蛋白降低，脂质沉积于肾小球，本身可诱导肾脏损害，而在糖尿病的基础上对肾脏的破坏更是严重。因此，本实验设计高脂血症组模拟糖尿病早期阶段，通过姜黄素B06的干预，提示对糖尿病早期即行药物干预能显著改善胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱及肾脏损伤情况。

DN时,肾脏结构及功能变化的主要原因之一是细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)的进行性积聚，从而引起系膜基质的增多，基底膜增厚。FN和Col-IV不仅是肾小球及肾小管基底膜的主要结构蛋白，也是DN时ECM增多的主要成分。Wahab[9]发现系膜细胞在高糖刺激下,分泌FN明显增多。FN是ECM中变化较早且明显的指标之一,FN的合成增加预示着ECM的过度积聚。Col-IV是肾脏细胞外基质最丰富的成分，属于典型的基底膜胶原，对于构建肾小球基底膜的支架具有重要的作用。生理作用是对肾小球毛细血管提供强而有韧性的支持作用，同时它的胶原纤维广泛地与系膜细胞和肾小球毛细血管基膜相连，可将系膜细胞的收缩活动传递至基底膜和毛细血管，以调控肾小球毛细血管的收缩活动[10]。另外，FN 作为一种始动因素,还可诱导Col-IV的形成、促进肾小球病变。因此，减少FN、Col-IV的表达，能减少ECM的沉积，从而保护肾小球结构及功能变化。

本实验通过采用高脂饮食结合小剂量链脲佐菌素成功制备高脂血症及糖尿病模型，并在实验中比较高脂组与糖尿病组，能更直观的观察到糖尿病不同阶段中肾脏的变化，是本实验的创新点之一。实验结果显示，DM组、HF组大鼠的血糖、血脂、血清Scr、BUN，肾脏组织内FN、Col-IV的表达水平均高于NC组，且DM组比HF组升高更明显，经姜黄素衍生物B06干预后，大鼠血糖血脂、血清Scr、BUN水平降低，FN、Col-IV的表达减少。且光镜下肾小球的形态接近于NC组的形态，肾小球体积大小一致，毛细血管基底膜厚度较均匀。肾小球系膜区胶原纤维减少，电镜下大鼠足突融合减轻。表明B06可以通过纠正糖脂代谢紊乱，减少2型糖尿病大鼠肾脏FN、Col-IV的表达，延缓ECM的沉积，减轻肾功能损伤，保护肾脏形态。提示B06可能为治疗糖尿病肾病的新靶点。

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Protective effect of curcumin derivative B06 on kidney of type 2 diabetic rats

ZENG Cong-cong1, LIU Xi1, LIU Wang-wang2, WANG Ling2, CHENG Jin-guo1,CHEN San-mei3△, CHEN Guo-rong2△

(1. the Second Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000; 2. Department of Pathology, the First Affiliated Hospital, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325015; 3. Medical Colledge, Shaoxing University, Shaoxing 312000， China)

Objective: To observe the effect and mechanism of curcumin derivative B06 on kidney from rats with hyperlipidemia and type 2 diabetes. Methods: Thirty five male SD rats were randomly divided into five groups(n=7): the normal control group, high-fat group, high-fat +B06-treatd group, diabetic group, diabetic +B06-treated group. After fed with high-fat diet for 4 weeks, the later two groups were injected with streptozotocin intraperitoneally to induce type 2 diabetes mellitus. B06-treated groups were given B06 by gavage at a dosage of 0.2 mg/kg·d for 8 weeks. After the treatment, the serum creatinine，blood urea nitrogen and uric acid were detected biochemically，the morphology of kidney was observed with light and transmission electron microscopy，the expression of collagen fibers was observed with Masson staining, the protein expression of collogen IV and fibronectin in kidney were determined by Immunohistochemistry. Results: It was showed that the levels of the serum creatinine and blood urea nitrogen elevated significantly in diabetic group. In high-fat and diabetic groups, increased glomerular mesangial matrix and collagen fiber and thicken glomerular basal membrane were observed under light microscopy, swelling and fusion of foot process were found under electron microscope; increased green matrix within glomeruli was observed under Masson staining. collogen IV and fibronectin protein expression were significantly enhanced in high-fat group and diabetic group. After B06’s intervention, the levels of serum creatinine and blood urea nitrogen were decreased in diabetic groups, the morphological change of kidney was obviously relieved, Collogen IV and fibronectin protein expression reduced. Conclusion: Curcumin derivative B06 exerts a protective effect on kidney in type 2 diabetic rats, reduced expressions of collogen IV and fibronectin, inhibition of the accumulation of extracellular matrix and glomerular mesangial proliferation, and then prevention of renal fibrosis may be the mechanism.

diabetes mellitus; hyperlipidemia; curcumin derivatives B06; collogen IV; fibronectin; kidney; rat

浙江省公益性技术应用研究计划项目(2011c23123)；温州市高层次人才创新技术项目

2014-10-08 【修回日期】2014-11-06

R587.1

A

1000-6834(2015)01-038-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.012

△【通讯作者】Tel: 13819738583， 13606751212； E-mail: chengr1978@aliyun.com， csm498@163.com