高效液相色谱法测定知柏地黄丸中3种成分含量

毛爱丽

(河南省鹤壁市食品药品检验所，河南 鹤壁 458030)

知柏地黄丸由熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓、知母、黄柏8味药材组方[1]，具有滋阴降火之功效，临床用于治疗阴虚火旺、潮热盗汗、口干咽痛、耳鸣遗精、小便短赤等证。其成分复杂，质量较难控制，且质量标准中只有马钱苷、丹皮酚的含量测定，而无君药黄柏中盐酸小檗碱的含量测定。为保证药品质量，本研究中建立了同时测定知柏地黄丸中马钱苷、盐酸小檗碱、丹皮酚3种成分含量的高效液相色谱法，现报道如下。

1 仪器与试药

UltiMate 3000型高效液相色谱仪(美国戴安公司);UV－240型分光光度计(日本岛津公司);pHS－3C型精密酸度计(上海电光器件厂);AE 240型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。知柏地黄丸(市售，用粉碎机粉碎处理);盐酸小檗碱对照品(批号为110713－200911，按 C20H18ClNO4计，含量为 86.8%，使用前不需处理)，丹皮酚对照品(批号为110708－200506，使用前不需处理)，马钱苷对照品(批号为 111640－201005，含量为 99.2%，置五氧化二磷减压干燥器中干燥12 h)，均购自中国食品药品检定研究院;乙腈、甲醇、三乙胺均为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:DiamonsilTM(钻石)C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相A为乙腈，B为磷酸盐缓冲液[0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液和 0.05 mol/L庚烷磺酸钠溶液(1∶1)，含 0.2%三乙胺，并用磷酸调 pH 至 3.0][2]，梯度洗脱(0～10 min，A 为 12% ，B 为88%;10～11 min，12%A→40%A，88%B→60%B;11～25 min，A为 40%，B 为 60%;25～26 min，40%A→12%A，60%B→88%B;26～29 min，A 为 12%，B 为 88%);流速:1.000 mL/min;检测波长:230 nm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL。

2.2 溶液制备

精密称取对照品盐酸小檗碱25.58 mg、丹皮酚49.96 mg、马钱苷25.36 mg，置同一50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。精密称取知柏地黄丸1.000 g，精密加入甲醇50 mL，加热回流15 min，置室温，补足减失的质量，摇匀，经微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。取缺黄柏、牡丹皮、山茱萸(制)的阴性样品1.000 g，按供试品溶液制备方法制得阴性对照品溶液。

图1 高效液相色谱图

2.3 方法学考察

专属性试验:按拟订色谱条件，分别取2.2项下3种溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，依法测定。结果供试品溶液色谱中，在与盐酸小檗碱、丹皮酚和马钱苷对照品溶液色谱相同保留时间处均出现相同的色谱峰，阴性对照品溶液色谱中则无此峰(见图1)。马钱苷保留时间为7.387 min，盐酸小檗碱为18.067 min，丹皮酚为21.273 min，峰分离度均大于3，理论板数均大于3 000。

线性关系考察:精密量取对照品贮备液，稀释成含盐酸小檗碱 为 1.776 3，2.664 4，4.440 7，8.881 4，13.322，17.762 7，26.644 1，35.525 4，44.41 μg/mL，丹皮酚为 19.984，29.976，39.968，59.952，79.936，99.92，119.904 μg/mL，马钱苷为 1.006 2，2.012 4，3.018 6，5.031，10.062，15.093，20.124，30.186，40.248，50.31 μg/mL 的系列混合对照品溶液。分别各精密吸取10 μL，按拟订色谱条件进样测定，以色谱峰面积(A)为纵坐标、质量浓度(C)为横坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系考察结果

精密度试验:精密量取同一对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，重复进样5次。结果盐酸小檗碱、丹皮酚、马钱苷的 RSD均为0.10%(n=5)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:取同一批样品6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定峰面积。结果盐酸小檗碱、丹皮酚、马钱苷的 RSD分别为 0.20%，0.20%，0.30%(n=6)，表明方法重复性较好。

稳定性试验:取同一供试品溶液，室温下避光密封放置，分别于 0，2，4，8，12 h时进样测定。结果盐酸小檗碱、丹皮酚峰面积的RSD 分别为 0.51% ，0.93% ，0.57%(n=5)，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

加样回收试验:称取已知3种成分含量的样品1.000 g，共9份;精密量取对照品贮备液10 mL，置100 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密量取该对照品溶液3，5，10 mL各3份，加入9份样品中，按拟订方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果(n=9)

2.4 样品含量测定

3 讨论

按拟订色谱条件，对3批样品制备的供试品溶液进行分析，将峰面积分别代入线性回归方程，计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果(mg/g，n=3)

取盐酸小檗碱、丹皮酚对照品，分别用甲醇溶解，使用UV－240分光光度计，于200～400 nm波长处扫描，3个成分的最佳检测波长分别为:盐酸小檗碱266 nm和229 nm(A266nm＜A229nm)，丹皮酚275 nm和228 nm(A275nm＞A228nm)，马钱苷236 nm。综合考虑，选择230 nm为测定波长。

称取样品适量，分别以甲醇－水(1∶1)、水、甲醇3种溶剂，采用回流及超声2种方法，分别提取60，30，15 min。结果超声处理不及回流效果好，前2种溶剂提取的样品中，盐酸小檗碱含量不及甲醇效果好，故采用甲醇提取。丹皮酚和盐酸小檗碱在热水中溶解，马钱苷在水中极易溶解。经水处理后，溶液黏稠度较大，不易滤过，且杂质峰较多，影响分离效果，故放弃。丹皮酚在提取过程中，易随蒸气挥发，故在回流过程中应注意密闭性，以减少成分损失。丹皮酚(4.248/4.125 mg/g)、马钱苷(1.498/2.047 mg/g)2 种成分的测定，与《中国药典(一部)》标准中单成分的测定相比，均能达到质量控制的目的。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社，2010:821－822，640－641.