红花提取物对Ⅰ型及Ⅱ型5α-还原酶的抑制活性研究＊

邓桂球，张 蓓，孔秀娟 ，张榕文 ，劳梓钊，万玉华，李 耿

(1.广东省广州市白云区第一人民医院，广东 广州 510140;2.广州中医药大学，广东 广州 510405;3.霸王＜广州＞有限公司)，广东 广州 510006)

类固醇5α-还原酶是雄激素代谢的关键酶，催化各种类固醇底物的△4，5双键还原，使睾酮(T)转化为生物活性更强的另一种雄激素——双氢睾酮(DHT)[1]。5α-还原酶是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白，目前认为其有3种同工酶[2]，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。5α-还原酶Ⅰ主要存在于肝脏及非生殖器官皮肤，发挥生理作用的最适pH为6～9;而5α-还原酶Ⅱ主要存在于前列腺、睾丸、附睾、精囊、头皮毛囊，作用最适pH为5.5[3]，5α-还原酶Ⅲ研究较少，其在难治愈的前列腺癌中过度表达[4]。多种疾病如前列腺增生[5]、雄激素脱发[6]、痤疮[7]、多囊卵巢综合征、男性假两性体畸形、女性多毛症[8]等均与局部雄激素代谢异常或雄激素作用有关，而5α-还原酶在其中有重要作用。目前市场上有许多合成的甾体和非甾体5α-还原酶抑制剂，但其往往有很多不良反应，难以满足广大患者的需求。因此，从中药中筛选出高效低毒的新型5α-还原酶抑制剂，将其运用于前列腺增生、雄激素脱发、痤疮等医药健康产品的研究，具有重要的研究价值和广阔的市场前景。近年来，国内外已有超过20种药物被报道具有较强的5α-还原酶抑制活性。红花有活血祛瘀功效，为中药育发液中臣药，有促进毛发生长的作用[9]。为进一步探讨其治疗雄激素脱发的机理，本试验中以5α-还原酶为研究靶点，考察红花提取物对该酶的影响，现报道如下。

1 材料与仪器

药品与试剂:红花(霸王＜广州＞有限公司)，经广州中医药大学赖小平教授鉴定为菊科植物红花 Carthamus tinctorius L.的干燥花;非那雄胺(美国默沙东制药有限公司);Easy-Lowyer蛋白测定试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司，批号为2813B);睾酮(纯度超过98%，BR，批号为#TCL201403);还原辅酶Ⅱ四钠盐/β-NADPH(纯度 98%，Roche公司，批号为 10041939103);Tris-HCL(南京森贝伽生物科技有限公司，批号为SBJ0055);PMSF(纯度超过99%，广州齐云生物技术公司，批号为#KY201211);DTT(纯度超过99%，广州齐云生物技术公司，批号为#py200611);磷酸盐缓冲液(PBS，上海立菲生物科技有限公司，批号为8113275);其他化学试剂都为国产分析纯。

仪器设备:戴安高效液相色谱仪(UVD170U型检测器，P680泵，ASI-100型自动进样器，TCC-1005型柱温箱);北京迪马DiamonsilTMC18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);TDL-5-A 型离心机(上海安亭科学仪器厂);XXW-80A型旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);BS110S型万分之一分析天平(香港佳立＜国际＞有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);RT-2100C型酶标仪(深圳雷杜公司)。

动物:雄性SD大鼠10只，SPF级，体重180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为20130020。

2 方法与结果

2.1 5α －还原酶的制备及定量[2，10]

制备:取雄性SD大鼠10只，禁食不禁水过夜后脱臼处死，迅速取肝脏及附睾(剥离脂肪组织)，称重，于冰盘上剪碎，加入3倍量预冷的匀浆液(1 mmol/L PMSF、1 mmol/L DTT、10%甘油、1 mol/L Tris-HCL 缓冲液;pH 分别为 5.5，5.5，6 ～9，6.8)在玻璃匀浆器中匀浆。匀浆液于4℃及3 500 g离心2次，每次10 min，取上清液，再以4℃及10 000 g离心50 min，取上清液即为粗微粒体酶，加一定量甘油，分装，保存于-80℃超低温冰箱中，临用前取出。

定量:采用改良Lowry法定量测定蛋白含量，以酶提物中的总蛋白含量表示5α-还原酶的浓度，操作按照试剂盒说明书进行。BSA 标准曲线为 Y=0.132 9 X+0.097 7，R2=0.993 2。经计算肝脏中粗酶浓度为12.17 g/L(Ⅰ型酶)，附睾中粗酶浓度为5.77 g/L(Ⅱ型酶)。

2.2 含量测定方法的建立

2.2.1 色谱条件

色谱柱:DiamonsilTMC18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 -水(70∶30);流速:1.0 mL/min;柱温:室温;检测波长:242 nm;进样量:20 μL。

2.2.2 方法学考察

专属性试验:精密吸取睾酮对照品溶液、空白溶液、空白溶液加对照品混合液，各取20 μL注入高效液相色谱仪。在上述色谱条件下，睾酮对照品峰峰形对称，与其他组分分离度好，见图1。

图1 高效液相色谱图

线性关系考察:精密称取睾酮标准品36 mg，用甲醇配制成浓度为5 mmol/L的睾酮母液。将溶液逐级稀释，质量浓度依次为1.44，7.20，14.40，28.80，115.20，230.40，460.80 μg/mL。按拟订色谱条件进样，以睾酮峰面积(A)对质量浓度(C)作图，绘制标准曲线。睾酮标准曲线为 A=0.263 C-0.410 6，R2=0.999 9。结果表明，睾酮质量浓度在 1.44～460.8 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验:取睾酮标准品母液，加甲醇稀释，得浓度为100 μmol/L的供试品溶液。按拟订色谱条件连续进样6次。结果的 RSD为1.01%(n=6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验:取睾酮供试品溶液，按拟订色谱条件，分别于0，2，6，12，24，48 h 时进样。结果的 RSD 为 1.37%(n=6)，表明睾酮溶液在48 h内稳定性良好。

重复性试验:取睾酮供试品溶液6份，按拟订色谱条件分别进样。结果的 RSD为2.11%(n=6)，表明方法的重复性良好。

2.3 5α－还原酶抑制剂体外模型的建立

5α-还原酶活性测定方法[10-12]:设置不同反应管和对照管，将Tris-HCL缓冲液、酶提取液、T、样品(阳性对照及空白对照)、NADPH依次加入反应管内，混合均匀，37℃反应30min，于0，30min时取样0.5 mL，加甲醇1 mL中止反应，涡旋1 min，5 000 r/min离心15 min，取上清液，0.22 μm微孔滤膜过滤，HPLC法检测。5α-还原酶活性以30 min内每mg酶液转化睾酮的量[T μmol/L(mg protein.30 min)]表示;T转化率%=(T0浓度测定值-T30浓度测定值)/T0浓度测定值×100%;5α-还原酶活性抑制率%=(未加抑制剂的反应体系T30转化量-加抑制剂的反应体系T30转化量)/未加抑制剂的反应体系T30转化量×100%。

微量反应体系的确立和反应条件优化:经过反复摸索，建立总量为1 000 μL的反应体系，见表1。为获得最佳酶活性测定反应参数，对底物T浓度、NADPH浓度、酶浓度、反应温度、反应时间条件进行优化。测得Ⅰ型酶的最佳反应条件为底物T浓度1 000 μmol/L，NADPH 浓度 1 mmol/L，粗酶浓度 0.7 g/L，反应温度37℃，反应时间30 min;Ⅱ型酶为底物T浓度1 000 μmol/L，NADPH浓度1 mmol/L，粗酶浓度3 g/L，反应温度37℃，反应时间30 min。

表1 5α-还原酶反应体系组成(μL)

非那雄胺对酶活性的影响:向反应体系中加入特异性Ⅱ型5α - 还原酶抑制剂非那雄胺，浓度依次为 0.02，0.1，0.5，1 μmol/L，按拟订方法进行酶促反应。求非那雄胺对酶活性的抑制率及IC50，评价该模型的可靠性。由图2可见，非那雄胺可呈剂量依赖性抑制5α-还原酶活性，抑制率高达83.67%，其IC50为212 nmol/L，与国外文献报道[13]的237 nmol/L接近。表明本试验采用HPLC法测定建立的5α-还原酶活性测定方法具有专一性，该模型可靠、稳定，可用于5α-还原酶抑制剂的筛选。

图2 非那雄胺浓度与抑制率关系

2.4 红花水提物对Ⅰ型及Ⅱ型5α－还原酶活性的影响

红花水提物样品的制备:取红花干燥药材150 g，室温下加入10倍量蒸馏水浸泡30 min，回流提取2次，每次0.5 h，8层纱布过滤，合并滤液，减压浓缩至浸膏状，将浸膏置于坩埚中，真空干燥箱中干燥，得红花药材粉末27.60 g，计算回收率。回收率(%)=干粉量/生药材量×100%，得回收率为18.40%。试验前取红花干燥粉末，用蒸馏水制成 50，10，2，0.4 g/L 的药物溶液，受试药物反应质量浓度分别为 2.5，0.5，0.1，0.02 g/L。

红花水提物对Ⅰ型酶活性的影响:分别取不同质量浓度的红花样品溶液，按拟订方法进行酶促反应，求红花水提物对Ⅰ型酶活性的抑制率，结果见表2。可见，与正常组比较，红花提取物0.02 g/L剂量组酶活力、T转化率均无显著性差异(P＞0.05)，0.1，0.5，2.5 g/L 剂量组酶活力、T 转化率均显著性降低(P ＜0.05)。说明红花提取物低剂量无显著5α-还原酶活性，体外剂量大于0.1 g/L时可极显著抑制Ⅰ型5α-还原酶活性，抑制率高达88.12%。

表2 红花提取物对Ⅰ型酶活性的影响

红花水提物对Ⅱ型酶活性的影响:分别取不同质量浓度的红花样品溶液，按拟订方法进行酶促反应，求红花水提物对Ⅱ型酶活性的抑制率，结果见表3。可见，与正常组比较，红花提取物0.1 g/L剂量组酶活力、T转化率均无显著性差异(P＞0.05);0.1，0.5，2.5 g/L 剂量组酶活力、T 转化率均极显著性降低(P ＜0.01)，说明红花醇提物低剂量无显著5α-还原酶活性，体外剂量大于0.1 g/L时可极显著抑制Ⅱ型5α-还原酶活性，抑制率高达61.65%。

表3 红花提取物对Ⅱ型酶活性的影响

3 讨论

目前，5α-还原酶活性测定方法有紫外分光法、HPLC法、气相色谱-质谱(GC-MS)法、酶联免疫吸附试验(ELISA)法、放射性同位素法、荧光法等。GC-MS法对试验仪器的要求较高;同位素法是国外最常用的甾体5α-还原酶的活性测定方法，其灵敏度高，同时可测定很多样品，但具有放射性污染，同位素标定和测定的误差、层析板处理过程中的操作误差等随机测量误差较多等缺点;紫外法操作简单，但由于所提取的酶为粗酶，纯度不高，且测定的目标物NADPH对5α-还原酶并无专一性，易受到其他酶的干扰而造成检测偏差;ELISA法比定量T更能准确反映5α-还原酶活性，但实际价格较贵。故本研究中选择HPLC法，以5α-还原酶的底物T为检测对象，排除了其他酶的干扰，且定量准确，误差较小。选用非那雄胺为阳性对照药评价该模型的可靠性，结果显示非那雄胺可呈剂量依赖性抑制5α-还原酶活性，抑制率高达 83.67%，其 IC50为212 nmol/L，与文献[13]报道的237 nmol/L相近。说明本研究中建立的HPLC法5α-还原酶抑制剂筛选模型稳定、可靠，可用于5α-还原酶抑制剂筛选。

彭永德等[14]指出，5α-还原酶Ⅱ对类固醇底物有较高的亲和力(Km为nmol范围)，而5α-还原酶Ⅰ的亲和力较低(Km在μmol水平)。本研究结果显示，5α-还原酶Ⅱ酶活力约 384.5 T μmol/L(mgprotein·30 min)，是5α-还原酶Ⅰ酶活力的10倍以上，其T转化率约47.82%，而5α-还原酶Ⅰ为18.45%。在细胞浆内，5α-还原酶可以将T转化为生物活性更强的DHT，T和DHT与同一种雄激素受体(AR)结合，但DHT与AR的亲和力是T的5倍以上。当AR与DHT等雄激素结合后，AR的LBD构象发生改变，与Hsp90等结合蛋白分离，AR形成活化的同源二聚体并进入细胞核中，识别并结合相应的靶基因启动子区的雄激素受体反应元件(ARE)，诱发或抑制靶基因的转录，合成特异性的信使RNA及蛋白质，从而发挥其生物学功能，促进性器官的发育，促进毛发、胡须等的生长等。因而转化T活力更强的5α-还原酶Ⅱ多分布在睾丸、附睾等生殖器官及头皮毛囊，主要对雄激素的合成代谢起作用;另一方面，T及其代谢产物DHT又均可刺激5α-还原酶Ⅱ基因的表达[15]，当5α-还原酶Ⅱ过表达时，又导致局部的雄激素过多，从而引起前列腺增生[5]、雄激素脱发[6]等疾病。5α-还原酶Ⅰ多分布在肝脏和非生殖器官皮肤，主要对雄激素和其他类固醇激素的分解代谢起作用，5α-还原酶Ⅰ过多表达时常导致痤疮[7]、女性多毛症[8]等。

5α-还原酶是体内参与雄激素代谢的一种重要的代谢酶，与全身多系统的疾病相关，抑制5α-还原酶的活性已成为一些疾病的治疗靶点。虽然2种异构酶表达具有相对的组织或细胞特异性，生理功能亦具有差异，如5α-还原酶Ⅱ主要分布在生殖系统、头皮毛囊内毛根鞘等部位，与生殖系统发育、毛发生长有关，5α-还原酶Ⅰ多分布在肝脏、皮肤细胞等，可能主要参与皮肤，尤其毛囊及皮脂腺成熟，对局部雄激素代谢、刺激皮脂过度分泌和痤疮的发生中有一定的作用。但在正常的的前列腺组织、头皮毛囊虽然5α-还原酶Ⅱ表达较多，也存在一定量的5α-还原酶Ⅰ表达。同时阻断Ⅰ型、Ⅱ型同工酶降低血清及局部组织中DHT的程度远比单独阻断Ⅱ型酶强，因此同时阻断Ⅰ型、Ⅱ型同工酶则是较好的选择。目前已在临床应用的双重5α-还原酶抑制剂度他雄胺在用于防治前列腺增生、雄激素脱发等取得了较好疗效，但也存在不同程度的不良反应，如性欲减退、勃起功能障碍等。本研究结果显示，红花提取物对5α-还原酶Ⅰ抑制率可达88.12%，对5α-还原酶Ⅱ抑制率可达61.65%，具有广阔的开发前景，但其作用的有效部位还需进一步研究。

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