超高效液相色谱法测定不同厂家丹皮酚软膏中丹皮酚的含量

张作华，赵新红，范 姗，李 珂

（山东第一医科大学（山东省医学科学院） 药学院，山东 泰安，271016）

丹皮酚是牡丹皮的主要化学成分之一，具有保肝、护肾、抗炎、镇定、降温、解热、镇痛、解痉等多种药理作用[1]。丹皮酚软膏是由丹皮酚和丁香油组成的软膏制剂，其主要成分为丹皮酚，主要用于皮肤湿疹、皮炎、皮肤瘙痒等各种皮肤疾病的治疗，具有抗过敏、消炎、止痒等作用[2]。该软膏制剂在卫生部药品标准中药成方制剂第十册中，采用紫外分光光度法测定丹皮酚的含量[3]，刘录等[4]采用高效液相色谱法测定丹皮酚软膏中丹皮酚的含量，本实验则采用超高效液相色谱法测定丹皮酚软膏中丹皮酚的含量。该法与高效液相色谱法相比，分析速度更快、时间更短、灵敏度更高，具有明显的优势，且其实验结果准确可靠，可用于丹皮酚软膏的质量控制。

1 仪器与材料

岛津 Nexera X2 型超高效液相色谱仪、LC-30AD 溶液输送单元、SIL-30AC 自动进样器、光电二极管阵列紫外可见光检测器 SPD-M30A、CTO-20AC 柱温箱、Labsolutions 色谱工作站，KQ-500E 型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FR224CN 型电子天平（奥豪斯仪器上海有限公司），有机 0.22μm 微孔过滤膜（津腾）。

Table 1 The compound paeonol cream from different manufacturers and batches 表 1 不同厂家及批次的丹皮酚软膏

甲醇（色谱纯，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司），水（娃哈哈饮用纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司），丹皮酚对照品（批号 110708-200505，供含量测定用，中国药品生物制品检定所），丹皮酚软膏厂家及批号见表 1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 µm），流动相为甲醇-水（体积比45 : 55），流速为 0.3 mL·min-1，紫外检测波长 274 nm，进样量 1 µL，柱温 35 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

取丹皮酚对照品约 5 mg，精密称定，置于 25 mL 棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，配制成质量浓度为 212 mg·L-1的丹皮酚对照品储备液，于 4 ℃ 温度下储存，备用。

2.2.2 供试品溶液的制备

精密称取各批次丹皮酚软膏约 10 mg，分别置于 10 mL 棕色量瓶中，加适量甲醇溶解摇匀，超声 30 min，冷却至室温，加甲醇定容，摇匀，并用 0.22 µm 滤膜过滤，备用。

2.2.3 阴性对照溶液的制备

取不含丹皮酚的软膏约 10 mg，精密称定，置于 10 mL 棕色量瓶中，同供试品溶液制备方法，经 0.22 µm 滤膜过滤，取续滤液，备用。

2.3 专属性试验

分别取上述对照品溶液（21.2 mg·L-1），供试品溶液（9.9 mg·L-1），阴性对照溶液各 1 µL，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱图。试验结果表明，在丹皮酚色谱峰位置处，阴性对照溶液无吸收，说明丹皮酚软膏中的其他物质不干扰丹皮酚的含量测定，色谱图见图 1。

2.4 线性关系考察

精密吸取对照品储备液 0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 和 4 mL 分别置于 10 mL 棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度线，摇匀，得到 1.06、2.12、5.30、10.60、21.20、42.40 和 84.80 mg·L-1的系列对照品溶液。精密吸取上述对照品溶液各 1 µL，注入液相色谱仪中，记录峰面积。以系列对照品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得到线性方程为 A = 1.606 8 × 104C + 1.009 9 × 104，r = 0.999 2。结果表明丹皮酚在浓度为 1.06～84.80 mg·L-1范围内，线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取浓度为 10.60 mg·L-1的对照品溶液 1 µL，连续进样 6 次，记录峰面积，计算 RSD。实验结果表明丹皮酚峰面积的 RSD 为 0.2%，表明该方法的精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密称取 5 号丹皮酚软膏约 10 mg 于 10 mL 棕色量瓶中，按“2.2.2”项下供试品处理方 法制得供试品溶液，并吸取制得的供试品溶液 0.5 mL 于 5 mL 量瓶，加甲醇定容至刻度线，摇匀，分别于 2、4、6、8、12 和 24 h 进样，记录峰面积，计算 RSD。计算得到峰面积的 RSD 为 0.3%，表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

Fig. 1 UPLC chromatograms of methanol (A), paeonol reference substance (B), paeonol ointment (C) and negative control solution (D) 图 1 甲醇（A）、丹皮酚对照品（B）、丹皮酚软膏（C）、阴性对照溶液（D）的UPLC色谱图

2.7 重复性试验

取同一批供试品 6 份（长春英平药业有限公司，批号18080547），按“2.2.2”项下供试品处理方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样 1µL，记录峰面积，将峰面积代入线性方程，计算丹皮酚软膏中丹皮酚的含量，得到丹皮酚质量浓度的 RSD 为 1.8%，小于 3%，结果表明该方法的重复性良好。

2.8 加标回收率试验

精密称取 3 份已知含量的丹皮酚软膏（丹皮酚质量分数为 51.60 mg·g-1）约 15 mg 于 25 mL 棕色量瓶中，分别加入供试品含量 80%、100%、120% 的丹皮酚对照品，各个浓度样品进样 3 针，计算加标回收率，实验结果如表 2。结果表明，三个浓度下的平均回收率分别为 104.3%、100.9%、98.3%，RSD 值均小于 3%，该方法的准确度较高。

Table 2 The determination results of recovery 表 2 回收率实验结果

2.9 含量测定结果

精密称取 1～6 号丹皮酚软膏 15.70、13.20、10.10、13.80、12.40 和 13.30 mg，分别置于10 mL 棕色量瓶中，按上述样品处理方法处理制备供试品溶液。按上述色谱条件进样测定，用外标法测定各批次丹皮酚的含量，含量测定结果如表 3。

Table 3 Contents of paeonol in compound paeonol cream from different manufacturers and batches 表 3 不同厂家及批次丹皮酚软膏中丹皮酚含量

3 讨论

本实验比较了不同流动相比例对色谱峰的影响，甲醇-水体积比分别为 40 : 60、45 : 55、55 : 45、60 : 40、65 : 35、70 : 30，并对液相系统的进样量 1、2、5 和 10µL 进行比较。结果表明，流动相比例为甲醇-水（体积比 45 : 55），进样量为 1µL 时，其色谱峰的峰形最好，柱效最高，且丹皮酚软膏中的其他物质与丹皮酚分离良好，不影响丹皮酚的含量测定。

不同厂家丹皮酚软膏中丹皮酚含量测定结果显示，山东明仁福瑞达制药股份有限公司所制软膏中所含的丹皮酚含量较高，长春普华制药股份有限公司所制软膏中所含丹皮酚相对较少。本实验采用超高效液相色谱法测定丹皮酚软膏中丹皮酚的含量，大大缩短了分析时间，提高了分析速度，且该含量测定方法的重复性较好，灵敏度也较高，实验结果准确可靠。因此，该方法可为丹皮酚软膏的质量控制和评价提供有益参考。