新型冠状病毒疫苗的研发策略及进展

李佳乐，王 汀

（安徽医科大学 药学院，安徽 合肥 230032）

2019 年 12 月，新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）在中国武汉地区爆发，它是一种由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染产生的急性呼吸道传染病，其传播途径主要是呼吸道飞沫传播和密切接触传播[1]。该冠状病毒肺炎的特点是感染率高、传播速度快、死亡率高。在多数新型冠状病毒感染的病例中，临床表现有发烧、咳嗽、乏力等，重型患者会继发出现呼吸困难、多器官衰竭，最终导致其死亡[2-4]。

随后，COVID-19 在全球大范围快速传播，在中国公布新型冠状病毒的全基因序列后，各国迅速启动了新型冠状病毒疫苗的研发工作。疫苗的作用机理是让机体接触一种不会导致疾病但是会引发免疫反应的抗原，这种免疫反应可以在病毒入侵机体时发挥作用，产生阻止、杀死病毒的效应。因此，COVID-19 疫苗是控制新型冠状病毒感染的一种替代手段，可以解决疫情的持续反复状态。目前至少有八种针对新型冠状病毒的疫苗试验，它们依赖于新型冠状病毒的不同部分，主要包括病毒疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗和亚单位疫苗（蛋白质疫苗）[5]。本文作者主要对SARS-CoV-2 的特点以及 COVID-19 疫苗的最新研究进展进行阐述。

1 SARS-CoV-2

冠状病毒在自然界广泛存在，最早是由 Tyrell 和 Bynoe 于 1966 年在上呼吸道疾病患者体内发现的，属于单正链 RNA 包膜病毒，会在人和各种动物中引起轻中度的呼吸系统、神经系统以及消化系统疾病[6]。如 2003 年在中国爆发的严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS-CoV）、2012年爆发的中东呼吸综合征冠状病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）等。与 SARS 和 MERS 相比，一些感染新型冠状病毒的患者在早期没有明显症状，潜伏期一般为 3-7 天[2]。

SARS-CoV-2 是一种 β 冠状病毒，是目前已知的第七种引发人类疾病的冠状病毒[7]，成熟的新型冠状病毒由核衣壳和包膜结构组成。核衣壳蛋白（nucleocapsid，N）包裹单正链 RNA 形成核衣壳；外部包膜上嵌有 3 种糖蛋白，分别是：刺突蛋白（spike，S）、膜蛋白（membrance，M）和包膜蛋白（envelop，E）[8]。S 蛋白是新型冠状病毒的一种标志性蛋白，位于病毒的最外层。一些研究表明，S 蛋白含有多个 N-糖基化位点，在新型冠状病毒入侵宿主系统中发挥着重要的作用，可以帮助识别、结合宿主细胞并介导病毒膜与宿主细胞膜相互融合，完成病毒入侵[9]。因此，S 蛋白是 COVID-19 疫苗开发的一个主要靶点。而 E 蛋白和 M 蛋白则在病毒组装时发挥作用[10]。

新型冠状病毒通过 S 蛋白与人类细胞表面的血管紧张素转化酶 2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE-2）受体相互结合入侵机体。病毒的 RNA 会充当 mRNA，在宿主细胞的核糖体内完成复制与翻译，并生成 RNA 聚合酶以及组装蛋白，完成病毒重新组装并大量释放[11]。抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APC）会吞噬病毒，对其进行加工处理后呈递在细胞表面，以激活 T 细胞和 B 细胞。B 细胞主要产生抗体，阻止病毒感染细胞，标记病毒进行破坏；细胞毒性T 细胞主要识别和破坏病毒感染的细胞以及靶细胞；辅助性 T 细胞能够帮助产生免疫反应；“记忆”B 细胞和“记忆”T 细胞可以在体内存积，以应对下一次的病毒感染，从而提高机体的免疫力。

病毒入侵机体后，宿主的免疫系统反应对患者发病的严重程度具有决定性的影响，临床结果通常与患者的年龄、ACE-2 的表达等因素有关[11-13]。相关研究结果表明，进行积极治疗的新型冠状病毒患者，在观察期间，通常会出现淋巴细胞减少，免疫系统遭到损害的现象。其细胞因子持续性释放，产生细胞因子风暴（cytokine storm），导致严重的肺损伤，同时低水平的免疫反应不足以应对病毒的入侵繁殖，也会加重病情[14-15]。

2 新型冠状病毒疫苗

基于结构的抗原设计、计算生物学、蛋白质工程和基因合成等技术的迅猛发展，为快速、精准地研发 COVID-19 疫苗提供了有力的帮助。目前所开展的 COVID-19 疫苗主要有以下 4 种：基于病毒本身的病毒疫苗、基于病毒 DNA、RNA 的核酸疫苗、经过基因改造的病毒载体疫苗以及基于病毒蛋白质的蛋白质疫苗[5]。由于冠状病毒 SARS-CoV-2 主要通过其表面的 S 蛋白入侵机体，S 蛋白还可以有效地刺激 T 细胞免疫反应[14]，因此这些疫苗主要针对 S 蛋白进行研发。

根据 SARS 病毒疫苗研制经验来看，记忆 T 细胞在 SARS 康复患者体内会长时间存在，比中和抗体发挥更长久的效果[16]。因此，研制 COVID-19 疫苗需要兼顾细胞免疫和体液免疫。此外，呼吸道、鼻腔部位可以研发引起黏膜免疫反应的疫苗，因为 COVID-19 的传播途径主要是呼吸道传播[4]，呼吸道等黏膜部位含有大量的免疫细胞，通过黏膜部位接种诱导的免疫反应，也可以发挥全身保护的作用。

2.1 病毒疫苗

病毒疫苗是以减弱或灭活病毒的形式进行接种，许多现有的疫苗都是以这种方式制造的，如针对麻疹和脊髓灰质炎的疫苗。病毒疫苗是将病毒在体外进行培养、增殖，削弱其毒性或者对其进行灭活处理后使用。其特点是研发技术成熟、容易研制，同时还可以保持病毒结构的完整性，产生较高的免疫反应等。但是经过灭活毒性处理后，病毒疫苗的免疫原性不足，需要多次接种才能发挥较好的效果，此外病毒疫苗还需要进行严格的安全测试。

减毒疫苗是一种由于病毒关键蛋白产生突变或者缺失而引起毒力下降的病毒疫苗。将 SARSCoV-2 进行基因引导，通过动物或人类细胞进行感染复制，直到它获得不易致病的突变，就可以制成减毒疫苗。该种疫苗具有较高的免疫原性，不需要进行多次注射就可以诱导持久性的全身性免疫反应和黏膜免疫反应。但是减毒疫苗的减毒时间难以确定，存在毒性回升的可能性，总体的安全性不高。美国 Codagenix 公司与印度血清研究所（Serum Institute of India Pvt. Ltd.）合作开发的 COVID-19 减毒疫苗，是通过改变 SARS-CoV-2 的遗传密码来削弱其毒性，达到预防感染的效果[17]。目前该疫苗已完成临床前研究，通过对老鼠和灵长类动物进行接种，初步显示出疫苗具有较好的免疫原性和安全性，已进入临床试验阶段[18]。

灭活病毒疫苗是一种传统型疫苗，通过紫外照射、甲醛等理化方式灭活制备。SARS 灭活病毒疫苗可以在体内诱导免疫反应，产生中和抗体[19]，灭活疫苗的抗原性与活病毒相似，但无法在体内复制，不存在毒性回升的可能，比减毒疫苗更安全。但有研究发现，灭活病毒疫苗引起的体液免疫应答较弱，无法刺激机体产生有效的细胞免疫应答，需要多次接种[20]。北京 Sinovac 生物技术公司研制的新型冠状病毒灭活疫苗“克尔来福”[21]，在小鼠、大鼠和非灵长类动物中均可以诱导产生中和抗体，接种后并未产生其他明显的不良反应。“克尔来福”正式展开了 I / II 期临床试验，对 743名受试者进行接种，不良反应以 1 级为主，大多受试者表现为接种部位疼痛、低热、乏力等反应。全程免疫 14 天后中和抗体阳转率达 90%，初步显示具有较好的免疫原性和安全性[22]；中国生物武汉生物制品研究所与中国科学院武汉病毒研究所合作研发的 COVID-19 灭活病毒疫苗也已经获得临床试验审批[23]，采用随机、双盲、安慰剂对照的 I / II 期临床试验，在 1120 名受试者中，按照低、中、高剂量组和 0.14、0.21、0.28 天不同程序进行接种，来评价灭活疫苗的安全性和免疫原性。接种后显示疫苗安全性好，在不同剂量组内均能产生高滴度的抗体，0.28 天程序接种两剂后中和抗体阳转率达 100%[24-25]。目前已经和阿拉伯联合酋长国达成合作，正式启动 III 期临床试验，是全球首个进入到 III 期临床试验的 COVID-19 灭活疫苗[25]；中国医学科学院医学生物学研究所自主研发的新型冠状病毒灭活疫苗已完成了近 200 名受试者接种的 I 期临床试验。目前已进入 II 期临床试验，需要对疫苗的免疫原性和安全性做进一步评价，并确定该疫苗的免疫剂量[26]。

2.2 核酸疫苗

核酸疫苗是基于 DNA 和 RNA 开发研制，又称基因疫苗，生产它们只涉及制造遗传物质，而不是病毒。COVID-19 疫苗包括 DNA 疫苗和 mRNA 疫苗两种。核酸疫苗是将抗原蛋白的外源基因直接接种机体，通过宿主细胞大量合成抗原蛋白，进而诱导免疫应答反应。其特点是可以快速地获取候选疫苗、具有持续性的免疫应答效力，还可以引起细胞免疫。但是至今尚无人用核酸疫苗成功上市，其安全性和免疫保护效力还有待进一步研究。目前针对 SARS 和 MERS 的核酸疫苗已经进入临床试验阶段，取得了良好的实效。COVID-19 核酸疫苗主要是将病毒表面的 S蛋白基因直接注射到机体中，利用机体产生大量的 S 蛋白，刺激机体产生免疫反应，应对 SARSCoV-2 的入侵感染。

针对 SARS-CoV-2 的 DNA 疫苗需要进入到细胞核才能实现病毒抗原的表达，可以同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答。DNA 疫苗可以通过 SARS-CoV-2 的基因序列直接制造疫苗。其接种形式主要有 3 种：肌肉注射接种、电穿孔仪接种、基因枪接种。其中，肌肉注射最为方便，但是注射进入的疫苗大多储存在细胞间质中，只有小部分可以进入到细胞核中。另外两种接种方式虽然可以使疫苗有效进入到细胞核中，但是成本较为昂贵。Inovio 公司和国内艾棣维欣公司合作开展的 DNA 疫苗 INO-4800 靶向 S 蛋白，临床前研究显示其能够诱导产生较强的中和抗体和 T 细胞免疫应答，目前正在展开 I 期临床试验[27-28]。其研发的 MERS-CoV 疫苗 INO-4700已经完成了 I 期临床实验，95% 的受试者体内都产生了较高抗体反应，表明该疫苗具有较好的耐受性和免疫原性，可以为疫苗 INO-4800 的研发试验提供基础[29-30]。

针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗不需要进入到细胞核内，只需要到达细胞质中就可以发挥病毒抗原表达的作用，具有较高的安全性和可操作性。美国国家过敏和传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIAID）和 Moderna 公司开发的 mRNA-1273 疫苗，可针对 S 蛋白发挥作用，是全球第一支进入临床试验研究的 COVID-19 疫苗[31]。I 期临床试验的受试者有 45 名，按照 25、100 和 250 mg不同计量组进行接种 2 次，间隔时间为 28 天，并接受 12 个月的随访。I 期临床试验的中期实验数据表明，45 位受试者均产生抗体，并未出现严重的不良反应。II 期临床试验在 600 名受试者中进行，初步显示该疫苗具有较好的耐受性、安全性和免疫原性。目前计划开展 III 期临床试验，受试者将扩大至 30 000名[32-33]；辉瑞与德国生物新技术公司 BioNTech 合作进行的 mRNA 疫苗 BNT162b1，为三聚化受体结构域（receptorbinding domain，RBD）mRNA 的脂溶性纳米制剂，同样靶向 S 蛋白。在 I 期临床试验中，45 名受试者分别接受 10、30 µg 接种，结果显示：2 组受试者体内的中和抗体滴度分别达到康复患者血清水平的 1.8 和 2.8 倍。不良反应主要是接种部位出现疼痛和发热反应，并未出现严重的不良反应。受试者还将接受超过 6 个月的 T 细胞反应监测，以便评估疫苗的安全性和免疫原性[34-35]，该疫苗 II 期临床试验也已经开展；云南沃森生物技术股份有限公司研发的 mRNA 疫苗已进入临床试验阶段，是中国首个获批进行临床实验的 mRNA 疫苗。临床前研究结果表明此疫苗可以在小鼠和食蟹猴体内诱导产生高水平的中和抗体和 T 细胞免疫反应，可以有效阻止病毒复制[36]。

虽然核酸疫苗具有引起全身性免疫应答的优点，但是较难产生黏膜免疫应答，因此可以联合其他疫苗应用，以加强免疫效果。

2.3 病毒载体疫苗

病毒载体疫苗是一类以病毒为载体的新型疫苗，将病毒抗原基因片段整合到载体病毒的基因序列中，可以诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。通过呼吸道、鼻腔、口腔等黏膜部位接种，还可以获得黏膜免疫应答反应。病毒载体疫苗主要分为 2 种：一种是仍然可以在细胞内复制的复制型，即以病毒载体作为搭载外源基因的载体，但是会保持其自身的传染性；另一种是由于关键基因已经被禁用而不能复制的非复制型，只能通过特定的转化细胞作用才能够进行复制。目前开展的病毒载体疫苗选用的病毒载体有：麻疹、腺病毒和副流感病毒等。将载体病毒进行基因改造，使 SARS-CoV-2 的关键病毒蛋白整合进入，就可以得到 COVID-19 病毒载体疫苗。载体病毒本身的毒性已经被削弱，因此不会造成加重感染的风险。

复制型 COVID-19 病毒载体疫苗采用的病毒载体有减毒麻疹、减毒流感病毒等。利用减毒的麻疹、流感病毒，携带 SARS-CoV-2 的 S 蛋白，接种后会刺激机体产生 2 种针对不同病毒的抗体，但是机体对载体病毒的免疫力可能会削弱疫苗的效力。利用减毒流感病毒还可以通过鼻腔滴注的方式进行接种，但是流感病毒的容量较小，限制了 S 蛋白的嵌合范围。厦门大学、四川大学等联合科研院利用流感病毒为载体研发的 COVID-19 病毒载体疫苗，已经进行到临床前研究阶段[23]。

非复制型 COVID-19 病毒载体疫苗主要是以腺病毒为载体。腺病毒自身具有较低的毒性，经过基因改造成无毒后，将 SARS-CoV-2 的 S 蛋白嵌入其基因组，接种后就会刺激机体产生细胞免疫应答，经过黏膜接种还会诱导粘膜免疫应答。但是大多数人体内都存在针对腺病毒的中和抗体，可能会降低此疫苗引起的免疫应答反应，因此需要增加接种剂量和次数，才能诱导持久的免疫力。目前美国强生公司正在利用腺病毒 Ad26 作为载体开发 COVID-19病毒载体疫苗[17]，计划在 1 045 名受试者中进行 I / II 期临床试验[37]；牛津大学展开的 ChAdOx1nCoV-19 疫苗是由黑猩猩腺病毒 ChAdOx1 制成的，临床前研究发现在恒河猴模型中单剂量 ChAdOx1nCoV-19 疫苗具有较好的安全性和有效性，可以有效地防止病毒在下呼吸道复制[38]。I 期临床试验显示该疫苗能够产生免疫反应，其结果正在跟进监测中，目前已经进入到 II / III 期临床试验[39-40]；军事科学院军事医学研究院生物工程研究所陈薇院士团队开发的 Ad5 腺病毒载体重组新冠病毒疫苗已经展开了 I 期临床试验。108 名受试者经过接种 28 天后，全部产生抗体，在不同剂量组内都取得了较好的耐受性，没有引起严重的不良反应。I 期临床试验结果表明腺病毒载体重组新冠病毒疫苗能够在 14 天内诱导产生特异性抗体和 T 细胞[41]，同时还发现了首个靶向 S 蛋白 N 端结构域（NTD）的高效中和单克隆抗体[42]。是全球首个进入到 II 期临床试验的 COVID-19 疫苗。

2.4 蛋白质疫苗

蛋白质疫苗是依据病毒蛋白质展开设计，如将纯化后的新型冠状病毒蛋白直接注射到人体内的亚单位疫苗，就是模仿新型冠状病毒外层的蛋白质片段或蛋白质外壳进行设计的病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）疫苗。

亚单位疫苗是经过基因工程纯化的重组蛋白疫苗，不含有病毒的基因组，具有较高的安全性和稳定性。纯化的蛋白主要采用病毒的尖峰蛋白或其关键部分，将 SARS-CoV-2 的 S 蛋白作为抗原基因，转化到细菌或昆虫细胞中，诱导其大量表达，经过纯化后就可得到 COVID-19 亚单位疫苗。但是此种疫苗的免疫原性较低，需要佐剂的辅佐配合及多次接种后，才能达到较好的免疫效应。COVID-19 亚单位疫苗可以通过鼻腔、呼吸道等黏膜部位接种，刺激粘膜免疫应答反应。中国科学院微生物研究所研发的 COVID-19 重组蛋白疫苗已经完成了前期的研发设计阶段[23]，该疫苗在转基因鼠和恒河猴的攻毒实验中表明其能够诱导产生高水平的中和抗体，显著降低肺组织的病毒载量，减轻肺部损伤[43]。目前已获得临床实验审批开展 I 期临床试验。

病毒样颗粒疫苗是模仿新型冠状病毒的外层蛋白质结构，但不具有病毒的遗传物质，不具传染性。这种疫苗可以触发强烈的免疫反应，但是生产技术不成熟，难以开展大规模的生产。Medicago公司研发的 COVID-19 病毒样颗粒疫苗是从烟草种属中产生类似于 SARS-CoV-2 的病毒样颗粒，已和 GlaxoSmithKline 公司展开合作，开展 II / III 期临床试验[44]。

3 对疫苗设计的思考

3.1 疫苗的研发特点

从 2019 年年末持续到现在的 COVID-19 已呈现出全球流行的趋势，成为一种地区获得性的传染性疾病。疫苗是控制 COVID-19 传播的有效途径，可以抑制疫情的扩散传播。然而疫苗的研发是一个漫长的过程，虽然全球各国在疫情爆发的第一时间就展开了研发，但是疫苗与病毒本身有着密切关系，仍需要进行长时间的监测和改进。

普通疫苗的研发主要包括前期设计研发阶段和临床实验阶段。前期设计研发一般包括分离病毒株来获得免疫原、疫苗结构设计、免疫效应测定、毒理研究等；而临床实验阶段主要针对临床实际应用，开展双盲实验等，具有较长的周期性。根据《药品特别审批程序》的规定，在突发公共卫生事件中可以加快防治药品的审批程序，COVID-19 疫苗的研发在保证疫苗的安全稳定性下可以相应地减少一定的审批程序[45]。

根据疫苗的设计类型不同，需要注意的问题也不尽相同。病毒疫苗需要重点关注可能会造成的抗体依赖性感染增强（antibody-dependent enhancement，ADE）现象和需要多剂量注射问题；核酸疫苗的安全性是研发过程中的关键问题；病毒载体疫苗需要筛选合适的病毒载体，并且考虑疫苗靶向性问题；蛋白质疫苗需要考虑添加合适的佐剂来提高免疫效应的问题。

3.2 疫苗的稳定性与安全性

COVID-19 疫苗主要是预防健康人感染病毒，如果疫苗的有效性得不到保证，不仅达不到预防的效果，还会产生额外感染的风险。因此，在疫苗设计阶段就应该对疫苗的免疫原性进行测试，免疫原性取决于疫苗本身的分子量和分子结构等性质。根据不同类型的疫苗进行相应的动物攻毒实验，可以帮助优化疫苗设计，保证疫苗的免疫原性处于良好的状态。在疫苗投入临床实验前应进行多批次的动物攻毒实验，不仅可以有效地确定疫苗的有效性，还可以评估疫苗接种后产生药品不良反应的可能性。

疫苗的安全性主要考虑在接种疫苗后出现的病理反应、不良反应以及非预期的免疫应答反应等。由于 COVID-19 疫苗为大分子生物制品，与病毒本身密切相关，需要进行严格的安全性监测。目前国内主要通过临床实验观察来评价疫苗的安全性，实验室测试阶段可以进行动物给药毒性试验、过敏试验和免疫毒性试验等来初步判断疫苗的安全性。在疫苗的临床试验阶段，一定要密切检测受试者的各项体征，针对新型 COVID-19 疫苗，安全性观察期可以适当延长。

3.3 疫苗佐剂的应用

蛋白质疫苗的免疫原性较低，需要添加免疫佐剂来加强免疫应答效应。免疫佐剂是一类非特异性免疫增强物，主要包括免疫调节分子类佐剂和抗原递送系统佐剂以及两类佐剂的联合体。

目前临床上使用的疫苗主要是通过皮下或肌肉注射接种，难以诱导粘膜免疫应答。由于SARS-CoV-2 主要是通过呼吸道传播，因此，粘膜免疫应答可以有效阻止其呼吸道的传播感染。采用脂质纳米粒子作为疫苗佐剂系统，可以靶向黏膜部位，利用铝的亲磷性，也可以得到稳定的疫苗制剂，还可以减少疫苗接种造成的局部炎症发生的概率。佐剂的选择需要在疫苗设计阶段就进行研究，选择合适的佐剂可以加强疫苗诱导的免疫应答反应，还可以减少疫苗接种的剂量与次数，降低疫苗毒性。添加的佐剂还需要进行全面的安全性研究。

3.4 SARS-CoV-2 变异的影响

病毒的遗传密码主要集中在核酸链上，在病毒入侵机体，进行复制、增殖时，基因组时刻在发生突变。在 SARS-CoV-2 不断传播扩散的过程中，很有可能出现病毒变异的情况。病毒基因突变对疫苗的研发工作具有很大的威胁，如果 SARS-CoV-2 发生较大程度的突变，研发中的疫苗就可能不再适应突变后的病毒。因此需要加大对病毒的监控力度，对临床上的 COVID-19 患者症状进行密切监测，以便当病毒发生变异时，能够及时地采取有效的措施来改进疫苗。

4 结论

COVID-19 是一种新发的呼吸道传染病，具有潜伏期长、传播速度快、感染范围大等特点，现阶段仍然呈现扩增的趋势。对于 SARS-CoV-2 的免疫逃避机制、致炎机制以及无症状传播的机理仍然需要进行深入研究。目前，针对 COVID-19 疫苗的研发主要是基于对 SARS 和 MERS疫苗研发的经验。现阶段，全球各国都已经展开了不同类型的疫苗设计研发，COVID-19 疫苗设计需要同时激发出体液免疫、细胞免疫以及黏膜免疫反应，才能取得较为有效的疫情防控结果。为了提高疫苗的免疫效力，可以联合使用多种不同类型的疫苗。虽然新型冠状病毒疫苗的研发制备技术已经偏向成熟，部分疫苗已经展开了临床实验，并取得了显著成效，但是疫苗研发是一个长周期的工作，还需要不断地进行优化和改进。