超高效及高效液相色谱法测定华法林钠片含量的结果比对

丁大中，宋梓瑜，于 毓

(山东省青岛市食品药品检验检测中心，山东 青岛 266071)

华法林钠为双香豆素的衍生物，临床应用广泛，其优点是作用强且稳定、可口服给药、应用方便、价廉且作用持久[1－2]。目前，进口华法林钠片采用《国家食品药品监督管理局进口药品注册标准》[3]检验，含量测定采用高效液相色谱(HPLC)法。超高效液相色谱(UPLC)法比HPLC法具有高效、快速、灵敏度和分辨率高、微量、经济及环境友好等优点[4－8]，但将其用于华法林钠含量测定还未见报道。本研究参考文献[9－12]，成功建立了测定华法林钠片含量的UPLC法，该方法操作灵敏、准确，且能实现高通量的分析样品。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(包含Empower色谱工作站，美国Waters公司);AG285型十万分之一天平(瑞士 Mettler Toledo公司);超纯水仪(美国Millipore公司)。华法林钠对照品(中国食品药品检定研究院，批号为101163－201001，含量为92.3%);磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号为20120104)、甲醇(德国Merch公司)、乙腈(德国Merch公司)均为色谱纯;超纯水(Millipore超纯水仪公司);华法林钠片(芬兰Orion Corparation公司，规格为每片 3 mg，批号分别为 1555638，1555639，1556716，1556720，1556722)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

HPLC色谱条件:色谱柱为Agilent Zorbax SB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以水(磷酸调 pH 至 3.0)为流动相 A、乙腈为流动相B，进行梯度洗脱;流速1.5 mL/min;柱温30℃;检测波长280 nm;进样量 20 μL。

UPLC色谱条件:色谱柱为Thermo Syncronis C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm);以水(磷酸调 pH 至 3.0)为流动相 A、乙腈为流动相B，进行梯度洗脱;流速0.5 mL/min;柱温30℃;检测波长280 nm;进样量5 μL。梯度洗脱方法见表1。

2.2 溶液制备

精密称取华法林钠对照品10 mg，置100 mL容量瓶中，加溶剂A(水∶乙腈=2∶8)振摇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(100 μg/mL)。取华法林钠片20片，精密称定总质量，研细，精密称取细粉(约相当于华法林钠5 mg)，置50 mL容量瓶中，加溶剂A适量，超声10 min使溶解并稀释至刻度，摇匀，离心，取上清液作为供试品溶液(100 μg/mL)。

表1 HPLC法与UPLC法梯度洗脱方法

2.3 UPLC方法学考察

线性关系考察:精密吸取 2.2 项下对照品溶液 3，4，5，6，8 μL，注入超高效液相色谱仪，按UPLC色谱条件进样测定。以样品峰面积(Y)为纵坐标、进样量(X，μg)为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y=4.36×106X －1.53×104，r=0.999 8(n=5)。结果，华法林钠进样量在0.284～0.758 μg范围内与峰面积线性关系良好。

最低检测限确定:以信噪比为3∶1(S/N=3)的浓度进样，华法林钠的最低检测限为0.02 ng。

精密度试验:取2.2项下同一对照品溶液，连续进样6次。结果华法林钠保留时间的 RSD为 0.06%，峰面积的 RSD为0.08%(n=6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验:精密称取同一批(批号为1555638)样品粉末6份，制备供试品溶液，按UPLC色谱条件进样测定。结果的 RSD为0.28%(n=6)，表明方法重复性良好。

稳定性试验:取2.2项下制备的同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24 h按拟定色谱条件依法进样 6次。结果峰面积的RSD为0.21%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

加样回收试验:精密称取半量已知含量的同一批(批号为1555638)样品细粉9份，按2.2项下方法制备供试品溶液，分别精密加入0.51 g/L华法林钠对照品溶液，稀释至刻度，摇匀，依法进样测定，计算回收率。结果见表2。

表2 华法林钠加样回收试验结果(n=9)

系统适用性试验:精密称取4－羟基香豆素和(E)－4－苯基－3－丁烯－2－酮对照品各10 mg，置100 mL容量瓶中，加溶剂A溶解，精密量取1 mL，置100 mL容量瓶中，精密加入2.2项下供试品溶液5 mL，加溶剂A溶解，精密量取5 mL置500 mL容量瓶中，加溶剂A稀释至刻度，即得供试品溶液。各组分的洗脱顺序为4－羟基香豆素、(E)－4－苯基－3－丁烯－2－酮和华法林钠，前两者峰的分离度应不小于2.5。结果及色谱图见表3和图1。

表3 HPLC法与UPLC法系统适用性试验结果对比

图1 系统适用性试验色谱图

2.4 样品含量测定

取5批样品，按2.2项下方法分别制备对照品和供试品溶液，分别按2.1项下HPLC和UPLC色谱条件进样测定，用外标法以峰面积计算含量。结果表明，在UPLC色谱条件下，华法林钠峰形良好，与杂质峰的分离度高，且UPLC和HPLC方法所得结果一致，见表4。HPLC法与UPLC法中华法林钠对照品与供试品的典型色谱图见图2。

表4 UPLC法和HPLC法含量测定结果对比(n=5)

图2 典型色谱图

3 讨论

梯度洗脱方法优化:原标准中HPLC法梯度洗脱时间为50min，流速为1.5 mL/min，时间长，流速大，消耗大量有机溶剂。采用UPLC 法将洗脱时间缩短至 12.5 min，流速降至 0.5 mL/min，时间和流速均减少了70%以上，实现快速测定含量，同时减少溶剂消耗量，极大地降低了成本，减少了环境污染。

流速选择:本研究中尝试了多种流速后发现，流速小时，华法林钠出峰时间长，使梯度洗脱时间过长，达不到快速分离的目的;流速大时，系统和色谱柱反压过大，无法正常分析样品;最后确定流速为0.5 mL/min，在系统可承受压力范围内和在保证分离效果的前提下，尽可能地缩短了梯度洗脱时间。

进样量选择:试验确定了方法的线性范围，并对系统精密度、重复性、稳定性和回收率进行了考察，结果显示，进样量小会降低方法的精密度和重复性，进样量大会超出线性范围，出现过载现象。最终确定了进样为5 μL。

系统适用性试验:由结果可见，2种方法均能良好地达到标准规定的要求，但UPLC法峰形更好，各组分间的分离度更优。

本研究中建立的UPLC法相比HPLC法用于华法林钠片的含量测定，具有检测效率高、灵敏度好、准确快速且绿色环保的优点，并可推广用于华法林钠其他制剂的含量测定。

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