环孢菌素A对再生障碍性贫血患者骨髓细胞Fas表达及凋亡率的影响

赵 芳，王 娟，张 睿，杨 博，许卫星，贺椿媛，刘 静，尹凤雷

(河北省沧州市中心医院，河北 沧州 061000)

再生障碍性贫血(简称再障)是以骨髓造血功能低下、全血细胞减少和贫血、出血、感染为主要表现的骨髓造血功能衰竭综合征，主要发病机制为免疫机制异常介导的T淋巴细胞对造血干细胞的直接攻击[1]，因此免疫抑制疗法可作为主要治疗手段之一。Fas/FasL系统可有效诱导细胞凋亡，不仅和正常造血相关，亦与造血病理及生理状态相关;有学者认为，细胞凋亡的增加是再障重要的病理、生理机制，但此方面的研究报道较少[2]。为此，本研究中观察了环孢菌素A(CsA)治疗再障的疗效，并分析其对患者骨髓细胞Fas的表达和凋亡等的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择我院2010年2月至2014年2月确诊的再障患者48例，其中男 26例，女 22例;年龄 17～64岁，平均(37.2±2.8)岁。将其中慢性再障(CAA)患者24例纳入CAA组，重型再障(SAA)患者24例纳入SAA组。SAA组患者中，男13例，女11例;年龄17～63岁，平均(37.1±2.7)岁。CAA 组患者中，男 13例，女 11例;年龄 18～64 岁，平均(37.5±1.7)岁。两组患者一般资料比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

两组均视患者实际病情给予常规支持治疗，如十一酸睾酮软胶囊(浙江医药股份有限公司新昌制药厂，国药准字H10970240，规格为每粒40 mg)，每日80 mg;大剂量的丙种球蛋白(山东泰邦生物制品有限公司，国药准字S20013001，规格为每瓶5% ∶50 mL)，每日0.4 g/kg，静脉滴注，1次/周，1个月为1个疗程。CAA组加用环孢素软胶囊(商品名新山地明，瑞士SADONA公司，注册证号H20140288，规格为每粒25 mg)，初始剂量每日2.5 mg/kg，血药浓度维持在150～200 ng/mL，服用3个月。SAA组加用环孢菌素A胶囊(用法同CAA组)，以及抗人T细胞猪免疫球蛋白ATG(武汉生物制品研究所有限责任公司，国药准字S10830001，规格为每瓶5 mL∶0.25 g)，每日3～5 mg/kg，静脉滴注，每日1次，5 d为1个疗程。两组患者在治疗期间需定期检测血常规，以及肝、肾功能等。两组在应用环孢菌素A治疗时均需监测血药浓度。

1.3 观察指标及疗效判定标准

分别于治疗前及治疗3个月后采集患者新鲜的骨髓标本2～4 mL，肝素抗凝，以淋巴细胞有关分离液分离单个核细胞(MNC)，将细胞浓度调整到 1×107个/mL，检测细胞凋亡率和Fas。其中CD34和Fas标记采用直接免疫法，抗体为抗CD34－PE，及抗 Fas－FITC(Pharmingen公司)，以FACSVantage SE分选型流式细胞仪(美国BD公司)测定;细胞凋亡率测定采用Boehringer Mannheim公司的原位末端标记(TUNEL)法，每组重复检测3次。依据张之南《血液病诊断及疗效标准》[3]中关于再障的疗效标准进行判定，分为明显缓解、进步及无效，以前两者合计为总有效。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析。计数数据比较行 χ2检验，计量数据比较行 t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结果见表 1。SAA组明显缓解 2例(8.33%)，总有效16例(66.67%);CAA 组明显缓解 4 例(16.67%)，总有效 21 例(87.50%)。SAA组明显缓解率显著低于 CAA组(P＜0.05);两组总有效率相比，差异无统计学意义(χ2=2.948，P ＞ 0.05)。

表1 两组患者骨髓细胞Fas表达及MNC凋亡情况比较(X ± s，%，n=24)

3 讨论

再障临床主要可分为CAA型及SAA型，治疗方案不尽相同。长期以来，雄激素被认为是治疗CAA的主要药物，十一酸睾酮是治疗再障的常用药物，疗效基本被认可。SAA患者普遍存在严重贫血症状，且机体免疫力较低，抵抗力较差，容易造成细菌或病毒性感染。丙种球蛋白可提升自身免疫力，增强抗病能力，但并无抗菌作用，故主要用于辅助治疗SAA。

环孢菌素A为免疫抑制剂，特异性较高，由11个氨基酸构成环形多肽[4]，对再障有效，国内外已广泛应用于临床。1995年在美国举办的第三十七届血液学年会上报告，环孢菌素A治疗再障的有效率为50%～60%，且患者血液学指标的改善时间通常为开始用药后的3个月[5]，但以往研究通常单用环孢菌素A，联用方案报道较少。本研究结果显示，SAA组总有效率与CAA组相比差异不显著(P＞0.05)，但SAA组明显缓解率显著低于CAA组(P＜0.05)，提示环孢菌素A联合雄激素及丙种球蛋白治疗方案对于控制再障的疗效较好。这种现象可能与环孢菌素A联用方案可通过抑制T细胞而促使T细胞亚群比例变化、恢复骨髓造血功能有关[6]。

本研究结果显示，环孢菌素A联用方案对Fas表达有一定的影响;同时，再障分型不同，Fas表达结果亦不相同，SAA型患者CD34+Fas+的细胞百分率往往会高于CAA型，且SAA和CAA患者CD34+Fas+的细胞百分率均高于健康人群(参考我院正常体检者有关资料)。这也反映了Fas和再障免疫发病机制有一定关联。进一步研究表明，CD34+Fas+的细胞百分率和骨髓细胞的凋亡率有一定相关性[7]。本研究亦发现，两者主要呈正相关联系(SAA患者 r=0.624，P ＜0.05;CAA 患者 r=0.631，P ＜0.05)。

另外，本研究中还发现，两组患者治疗后MNC凋亡率均显著低于治疗前，且CAA组显著低于SAA组治疗后，与朱琳超等[8]报道一致，表明以环孢菌素A联用方案可明显减少再障患者骨髓MNC凋亡。这可能是因为再障时，骨髓的造血功能衰竭而引发全血细胞数量的减少，无论其初始病因怎样变化，造血干细胞的数量减少均为其基本特征。有研究发现，环孢菌素A联用方案能降低某些促凋亡因素而减少骨髓损伤，抑制活化T细胞有关功能，减少对Fas高表达的CD34+细胞攻击，最终明显改善造血功能[9－11]。在本研究过程中发现，以TUNEL方法检测后，再障患者MNC的凋亡率整体而言处于增高趋势，治疗后又下降，这证实细胞凋亡在再障发病中发挥了一定的影响。综上所述，细胞Fas异常表达和再障的发病有一定联系;环孢菌素A联用方案治疗再障，可明显降低其骨髓MNC凋亡率，且联用效果更佳。但需要指出的是，由于研究样本量较少，结果仍需大样本试验进一步验证。

[1]杨雪晶，张伟华，张秀莲，等.蛋白激酶Cθ在再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞中的表达及对Th1、Tc1细胞的作用[J].中华血液学杂志，2012，33(11):951 －953.

[2]孙伟正，王金环，马智刚，等.补髓生血颗粒对慢性再生障碍性贫血患者骨髓造血细胞黏附作用影响的研究[J].中华中医药杂志，2005，20(2):89－91.

[3]张之南，沈 悌.血液病诊断及疗效标准[M].第2版.北京:科学出版社，1998:33－35.

[4]李 风，肖 亚，王平贤，等.环孢菌素A代以他克莫司延缓移植肾慢性失功临床研究[J].重庆医学，2009，38(17):2 139－2 141.

[5]沈红石，任传路，陈海飞，等.T－bet、GATA－3与T细胞亚群在再障中的相关性研究[J].现代生物医学进展，2012，12(9):1 677－1 679.

[6]Xiao Y，Jiang ZJ，Pang Y，et al.Efficacy and safety of mesenchymal stromal cell treatment from related donors for patients with refractory aplastic anemia[J].Cytotherapy，2013，15(7):760 － 766.

[7]Ismail M，Gibson FM，Gordon－Smith EC，et al.Bcl－2 and Bcl－x expression in the CD34+cells of aplastic anaemia patients:relationship with increased apoptosis and upregulation of Fas antigen[J].Br J Haematol，2010，113(3):706 － 712.

[8]朱琳超，刘永林，周郁鸿，等.流式细胞术检测慢性再生障碍性贫血患者 T细胞活化的研究[J].浙江中医药大学学报，2012，36(7):767－769.

[9]Ren CA，Li YX，Cui JY，et al.Efficacy of glycyrrhizin combined with cyclosporine in the treatment of non － severe aplastic anemia[J].Chin Med J(Engl)，2013，126(11):2 083 － 2 086.

[10]王迎雪，徐从高，冉俊丽，等.再生障碍性贫血患者骨髓自然杀伤T细胞体外活化特性研究[J].中华血液学杂志，2010，31(8):536－539.

[11]许俊羽，郭金凤，周 颖，等.成人异基因造血干细胞移植术后影响环孢素A血药浓度的相关因素考察[J].中国药房，2013，24(14):1 289－1 290.